探讨广州市1例输入性恶性疟病例的流行病学特征，以明确其传播风险。
选择2016年4月9日，于广州血液中心进行全血捐献后第14天后被确诊为恶性疟的1例无偿献血者，以及接受由本例献血者所捐献全血制备的红细胞输注的1例受血者为研究对象。收集2例受试者的流行病学资料，开展流行病学调查。2016年4月27日，采集本例献血者全血样本5 mL；2016年4月27日和2016年5月12日，分别采集本例受血者全血样本各5 mL，共计3份全血样本。采用血涂片镜检对3份全血样本进行疟原虫病原学检查，采用巢氏PCR法对3份全血样本进行疟原虫核酸检测。根据巢氏PCR扩增产物的DNA测序结果，对疟原虫基因进行基因分型和构建分子系统进化树。
①本例献血者有境外疟疾流行区务工史，回国后出现畏寒、发热等类似疟疾的临床表现。根据其全血样本血涂片镜检结果，诊断为恶性疟疾。②本例受血者并未出现疟疾典型临床症状，其2份全血样本血涂片镜检结果，均未发现疟原虫。③本研究献血者与受血者全血样本巢式PCR检测结果均为恶性疟原虫阳性；献血者和受血者的3份全血样本疟原虫18S rRNA基因序列的序列同源性比对结果显示，3条基因序列相似度为100%，并且均为恶性疟原虫基因序列，与临床血涂片镜检结果一致。④分子系统进化树构建结果显示，本研究献血者和受血者3份全血样本的疟原虫18S rRNA基因分型均为恶性疟原虫基因型，并且基因序列处于同一根部，这进一步证实本例受血者的疟疾感染来自本例献血者。
本例献血者为非洲输入性恶性疟，受血者因输注由该例献血者所捐献全血制备的红细胞，亦发生恶性疟原虫感染，但是并未出现疟疾典型临床症状。
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常见的经输血传播的疾病，除病毒感染性疾病外，亦可传播原虫感染性疾病。疟疾(malaria)是全球广泛关注的重要公共卫生问题之一。疟疾是由疟原虫(Plasmodium)感染引起的疾病，人体被携带疟原虫的蚊虫叮咬后，经过10～20 d潜伏期，逐渐出现明显不适、厌食、疲惫等临床症状，疟疾发病通常经历发冷期、发热期、出汗期和间歇期4个典型阶段。根据世界卫生组织(World Health Organization，WHO)报道，2000－2013年全球超过40%个体受到疟疾的威胁，每年疟疾新发病例为(3.5～5.0)×108例，疟疾死亡病例约为1.1×106例，每天约3 000例儿童死于疟疾；全球疟疾病例主要分布在非洲(59%)和亚洲(38%)，少数分布在美洲(3%)，疟疾在经济发达的欧洲国家非常少见，但是自2006年以来，少数西欧国家已出现无旅行史或者输血史的恶性疟病例报道[1]。
文献报道，中华人民共和国成立初期我国每年疟疾新发病例数高达3×107例以上，经过多年疟疾防控工作，已经取得了非常显著的成绩，截至2015年底，我国除云南省部分边境地区外，其他地区已基本无本地感染疟疾病例[2]。然而，随着世界各国交流日益频繁，旅游、外出务工等流动人口不断增加，输入性疟疾成为大部分地区主要的疟疾传播途径。全球大多数国家并未将疟原虫筛查作为献血者常规检测项目，因此通过输血导致的疟疾时有发生[3,4,5]。
2016年4月23日广州市1例献血者于广州血液中心献血后第7天，开始出现畏寒、发热等临床症状，上述临床症状持续5 d后，于广州市第八医院就诊，并于2016年4月27日被确诊为恶性疟疾。此时，由本例献血者所捐献全血制备的红细胞已运送至临床，并且用于受血者输血治疗。因此，本研究拟通过对本例疟疾感染献血者及其受血者的相关流行病学资料，以及实验室检查结果等临床资料进行分析，旨在了解本例疟疾感染献血者体内的疟原虫是否通过输血传播导致受血者疟疾感染。现将研究结果报道如下。
选择2016年4月9日，于广州血液中心进行全血捐献的1例无偿献血者，以及接受由本例献血者所捐献全血制备的红细胞输注的1例受血者为研究对象。本例献血者、受血者均为男性，年龄分别为32岁与73岁。献血者纳入标准：①献血后第14天(2016年4月23日)，于广州市第八医院确诊为恶性疟疾；②由其所捐献全血制备的红细胞已运送至临床，并且用于输血治疗。受血者纳入标准：接受由本例献血者所捐献全血制备的红细胞输注。
DNA提取试剂盒(Quick Gene DNA-whole blood kit，批号：71607-08，日本Kurabo公司)；2×GoTaq®无色反应缓冲液(GoTaq Colorless Master Mix，批号：0000224233，美国Promega公司)。610L型DNA自动提取仪(日本Kurabo公司)，9700型PCR扩增仪(美国ABI公司)，Gel Doc XR型凝胶成像仪(美国Bio-Rad公司)。
对本例疟疾感染献血者进行流行病学调查，包括居住地、外出旅行和务工史，以及献血、输血史等。调查受血者所有相关输血源的信息，以及是否出现疟疾典型临床症状。
2016年4月27日于广州市第八医院，抽取本例疟疾感染献血者肘静脉血全血样本5 mL，采用乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA)抗凝，送往广州血液中心，待检。2016年4月27日和2016年5月12日分别于广东省人民医院，抽取本例受血者肘静脉血全血样本5 mL，采用EDTA抗凝，送往广州血液中心，待检。
对本研究献血者及受血者EDTA抗凝外周血，均制备厚、薄血涂片。血涂片经干燥、固定、Giemsa染色后，于光学显微镜下观察血涂片中疟原虫形态，并对其种类进行鉴定，记录观察结果。
分别取本研究献血者与受血者EDTA抗凝全血2 mL，采用DNA提取试剂盒及DNA自动提取仪，提取2例受试者全血中疟原虫DNA，试验操作严格按照试剂盒及仪器说明书要求进行。将提取后DNA含量调整为1.65～1.80。
通过美国国立生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)GenBank数据库(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)，检索恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)、间日疟原虫(Plasmodium vivax)、三日疟原虫(Plasmodium malariae)和卵形疟原虫(Plasmodium ovale)的18S rRNA基因序列，并且参考文献[5,6,7]，采用Primer Premier 5.0软件(加拿大Premier公司)设计巢式PCR引物，并与NCBI Nucleotide数据库(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/)中的疟原虫参比序列比对，以验证引物特异性。本研究所用参比序列的GenBank进入号如下，间日疟原虫：Q627157.1，恶性疟原虫：KT991226.1，三日疟原虫：KJ934253.1，卵形疟原虫：EU935736.1。引物委托上海赛默飞世尔科技有限公司合成与纯化。本研究4种疟原虫18S rRNA基因巢式PCR扩增引物，见表1。
本研究疟原虫18S rRNA基因巢式PCR扩增引物序列
本研究疟原虫18S rRNA基因巢式PCR扩增引物序列
| 引物名称 | 引物序列(5′→ 3′) | 产物长度(bp) | |
|---|---|---|---|
| 疟原虫属 | 1 200 | ||
| rPLU5 | CCTGTTGTTGCCTTAAACTTC | ||
| rPLU6 | TTAAAATTGTTGCAGTTAAAACG | ||
| 恶性疟原虫 | 205 | ||
| rFAL1 | TTAAACTGGTTTGGGAAAACCAAATATATT | ||
| rFAL2 | ACACAATGAACTCAATCATGACTACCCGTC | ||
| 间日疟原虫 | 120 | ||
| rVIV1 | CCTCTTGGTGTTGGTCTTTGC | ||
| rVIV2 | ACTTCCAAGCCGAAGCAAAGAAAGTCCTTA | ||
| 三日疟原虫 | 144 | ||
| rMAL1 | ATAACATAGTTGTACGTTAAGAATAACCGC | ||
| rMAL2 | AAAATTCCCATGCATAAAAAATTATACAAA | ||
| 卵形疟原虫 | 800 | ||
| rOVA1 | ATCTCTTTTGCTATTTTTTAGTATTGGAGA | ||
| rOVA2 | GGAAAGGACACATTAATTGTATCCTAGTG | ||
注：rPLU5、rPLU6引物分别为疟原虫属18S rRNA基因第1轮巢式PCR扩增正、反向引物，rFAL1、rFAL2引物分别为恶性疟原虫18S rRNA基因第2轮巢式PCR扩增正、反向引物，rVIV1、rVIV2引物分别为间日疟原虫18S rRNA基因第2轮巢式PCR扩增正、反向引物，rMAL1、rMAL2引物分别为三日疟原虫18S rRNA基因第2轮巢式PCR扩增正、反向引物，rOVA1、rOVA2引物分别为卵形疟原虫18S rRNA基因第2轮巢式PCR扩增正、反向引物
对本研究献血者与受血者血液样本中提取的DNA进行巢式PCR扩增，共计2轮。第1轮巢式PCR反应体系为50 μL，包括2×GoTaq®无色反应缓冲液25 μL，引物rPLU5、rPLU6(浓度均为10 μmol/L)各2 μL，模板DNA 2 μL，灭菌蒸馏水19 μL。反应程序为：94 ℃ 3 min，94 ℃ 30 s，59 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，35个循环；72 ℃ 5 min。第2轮巢式PCR反应体系为50 μL，包括2×GoTaq®无色反应缓冲液25 μL，第2轮巢式PCR扩增引物(浓度均为10 μmol/L)各2 μL，第1轮巢式PCR扩增产物的模板DNA 1 μL，灭菌蒸馏水20 μL。第2轮巢式PCR反应程序与第1轮相同。吸取第2轮巢式PCR反应产物5 μL，采用2%琼脂糖凝胶电泳后，进行凝胶成像观察。
将本研究献血者与受血者的巢式PCR反应产物送至深圳华大基因科技有限公司检测，获得疟原虫18S rRNA基因的正、反向测序DNA序列。采用DNASTAR软件(美国Lynnon Biosoft公司)，对测序结果进行基因序列拼接后，将拼接基因序列与GenBank数据库的参比序列进行BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)同源性比对。同时，采用BioEdit软件(美国Borland公司)对测序结果进行核苷酸运算和分析，最后采用Mega 5.1软件(美国亚利桑那州州立大学)，并且参考文献[8]中相关方法对疟原虫18S rRNA基因进行基因分型，以及构建分子系统进化树。
本例献血者于2016年4月18日，出现不明原因畏寒、发热，体温高达39.5 ℃，反复发作3次，多以夜间发热为主，无抽搐，伴有头痛、头晕，恶心，呕吐胃内容物数次，非喷射性，全身乏力，无四肢关节酸痛。2016年4月23日，本例献血者就诊于广州市第八人民医院，根据血涂片镜检结果，诊断为恶性疟原虫阳性，并接受住院治疗。2016年4月20日，本例受血者因胆囊炎于广东省人民医院接受住院治疗，4月22日行胆囊手术，手术顺利；4月23日，因术后血红蛋白水平低，临床对其输注由本例疟疾感染献血者所捐献全血制备的红细胞1 U，输血过程中及输血后均未发生不良反应。
2016年4月2日，本例献血者从刚果民主共和国回国至广州，有疟疾流行区务工史，在刚果民主共和国期间无输血史、少外出就餐、无鱼生进食史、无疫水接触史、无野外作业史、无病畜咬伤史。本例献血者回国后，在未知自己感染疟疾的情况下参加无偿献血，并且由其所捐献全血制备的红细胞被输注至本例受血者。本例受血者住院治疗期间，仅输注由本例献血者所捐献全血制备的红细胞1 U，并且输血后并未出现疟疾典型临床症状。
本例献血者于2016年4月27日抽取的全血样本血涂片镜检结果显示，发现形态典型的恶性疟原虫环状体和配子体。本例受血者分别于2016年4月27日和5月12日抽取的全血样本血涂片镜检结果显示，均未发现疟原虫。
本研究献血者和受血者3份全血样本的疟原虫18S rRNA基因巢式PCR扩增结果显示，扩增产物长度均为205 bp，均为恶性疟原虫18S rRNA基因扩增目的条带，见图1。本例献血者全血样本中疟原虫18S rRNA基因巢式PCR扩增产物DNA片段测序结果，见图2。本研究献血者和受血者的3份全血样本中，疟原虫18S rRNA基因序列的BLAST序列同源性比对结果显示，3条基因序列相似度为100%，并且均为恶性疟原虫基因序列，与临床血涂片镜检结果一致。
注：条带1为本例献血者全血样本中疟原虫巢式PCR扩增产物电泳条带，条带2、3为本例受血者全血样本中疟原虫巢式PCR扩增产物电泳条带，N为空白对照。DNA marker为DNA分子量标志物
本研究献血者和受血者3份全血样本中，疟原虫18S rRNA基因分型结果与恶性疟原虫参比序列(KT991226.1)在同一进化树根部，并且3条序列在进化树上的位置相同，见图3。
注：Donor表示本例献血者全血样本中恶性疟原虫18S rRNA基因在进化树中的位置，Receptor1和Receptor2表示本例受血者不同时间点采集的2份全血样本中恶性疟原虫18S rRNA基因在进化树中的位置
近年，随着血液检测流程的不断规范，以及检测技术的持续发展和革新，特别是生物检测技术的创新，经输血传播疾病的常规检测项目，例如乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人类免疫缺陷病毒等，已经达到核酸检测水平。这极大地缩短了经输血传播病毒"窗口期"时间，可有效降低经输血传播病毒的风险。但是，其他新发和非常规检测的经输血传播疾病，仍然可能造成输血安全隐患，危害受血者健康。活体疟原虫可通过输注全血、悬浮红细胞、浓缩血小板、浓缩白细胞等血液制品途径，传播至受血者体内，导致受血者感染疟原虫[9]。通过输血感染疟疾的典型临床症状与常见蚊虫传播疟疾相似，通常表现为周期性高热、寒颤、出汗退热3个典型发病阶段，而后进入间歇期，以此循环往复，患者可出现继发性贫血与脾大等并发症[10]。此外，通过输血感染疟疾的临床症状经常因患者原发疾病尚未治愈或者使用抗生素等治疗药物而被掩盖，不易被临床鉴别诊断，从而延误最佳治疗时机，特别是对免疫功能低下的患者造成致命的威胁。
自2010年以来，我国疟疾疫情已经得到有效控制，国内感染疟疾病例大幅度减少，但是随着国际间经济、文化交流的日趋频繁，出国旅游及务工热潮高涨，输入性疟疾病例显著增加。2012年我国90%以上疟疾病例为境外输入性疟疾，这对疟疾疫情相对稳定地区造成了潜在的疟疾传播风险[11]。本例献血者为1例典型的输入性恶性疟病例，由于恶性疟原虫感染潜伏期短，并且导致的患者病死率较高，因此恶性疟病例从发病至被确诊的时间，是影响临床对该病患者抢救和治疗效果的重要因素。WHO建议，临床对于恶性疟的诊断和治疗，必须在恶性疟发病后24 h内完成[1]。虽然本研究中受血者并未出现严重的恶性疟临床症状，但是由于从受血者接受由本例献血者所捐献全血制备的红细胞制品输注至采取青蒿素治疗的时间长达16 d，受血者存在着致命的风险。因此，对经输血感染疟疾的及时发现与诊断、治疗，是极其重要的。
输血性疟疾的潜伏期由经输血输入的疟原虫数量、种类和受血者自身免疫功能决定，通常为7～30 d[12]。正常情况下，由静脉输血传播疟疾的潜伏期较短，而恶性疟发病周期一般为(10.5±4.9)d[9]。传统的血涂片镜检法通常作为疟疾实验室检查的金标准，但是需要检验科工作者具有丰富的检验经验，并且检验结果受到一些客观因素的影响。例如疟原虫密度低和用药后疟原虫虫体形态发生变化的疑难样本，经常给疟疾诊断增加难度，容易出现误诊和漏诊等情况[13]。目前，各国已经建立了多种疟原虫分子生物学检测方法，多项研究结果证明，PCR检测疟原虫的敏感度和虫种鉴别方面优于镜检法，可作为疟疾实验室诊断的确诊方法[14,15]。本研究中，受血者从接受由本例献血者所捐献全血制备的红细胞输注至确诊为恶性疟的时间长达16 d，血涂片镜检结果未见活体疟原虫，这可能与献血者体内疟原虫浓度低，以及输注的血液制品已在血库存放了2周导致疟原虫浓度进一步降低有关。本研究采用巢式PCR对本例献血者及受血者全血样本进行检测，均发现恶性疟原虫的基因组，说明巢式PCR检测对疟原虫密度极低的疟疾患者和携带疟原虫者，检测敏感度和精确度高。本研究中，由疟原虫18S rRNA基因测序结果构建的分子系统进化树结果显示，本例献血者及受血者3份全血样本的疟原虫18S rRNA基因分型结果与恶性疟原虫参比序列(KT991226.1)在同一进化树根部，并且3条序列在进化树上的位置相同，这表明，本例献血者与受血者的疟原虫18S rRNA基因分型均为恶性疟原虫基因型，并且基因序列相同，献血者与受血者疟原虫基因来源一致，证明了受血者为经输血传播的疟疾感染。
目前，广州市已进入消除疟疾阶段，自2011年以后，本市所有恶性疟病例均为输入性病例，恶性疟原虫感染者均有东南亚或者非洲等疟疾高发区的旅游或务工史，这说明广州市输入性恶性疟病例以东南亚和非洲等地区的归国人员为主。为了降低输入性疟疾感染风险，笔者建议，临床上需要加强对医院检验科技师疟疾诊疗技术培训，提高检验技师对疟原虫的鉴定水平，对于疑难样本可采用疟原虫检测敏感度更高的实验室生物技术进行确诊。在管理方面，采供血机构工作人员需要注意：①应加强对献血者的献血健康征询和体格检查，根据我国《献血者健康检查要求GB 18467—2011》相关规定，在筛选献血者时，应认真询问病史，凡3年内有疟疾感染史，3年内有居住在疟疾流行国家及1年内有前往疟疾流行国家者，均必须延迟献血，并且建议针对有出入境记录的献血者进行免费的疟疾相关项目检测。②国家卫生行政部门应在机场及边境口岸对疟疾流行区域出入境人员加强经输血传播疟疾相关知识的宣传和教育，从而降低输入性疟疾的感染风险。
利益冲突 无
