哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，通过调控不同种类T细胞、B细胞和树突状细胞(DC)，参与自身免疫性溶血性贫血(AIHA)发病。mTOR抑制剂作用于mTOR信号通路，可以发挥上调调节性T细胞(Treg)数量，下调辅助性T细胞(Th)1、Th2、Th17数量的作用，在复发/难治性AIHA的治疗中发挥重要作用。笔者拟对mTOR分子结构及其信号通路，mTOR参与免疫细胞的调控，以及mTOR抑制剂治疗AIHA等进行综述。
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哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)是一类进化保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，参与免疫细胞的基因转录、蛋白质翻译、核糖体合成和细胞凋亡等生物过程，调控免疫细胞的生物学特性及功能[1]。自身免疫性溶血性贫血(autoimmune hemolytic anemia，AIHA)是一类产生抗红细胞自身抗体导致红细胞破坏增多，寿命明显缩短的免疫性血细胞减少症，B细胞在T细胞辅助作用下功能亢进，产生和分泌自身红细胞抗体，而T细胞在AIHA发病中发挥重要作用[1]。mTOR抑制剂作用于mTOR信号通路，可以发挥上调调节性T细胞(regulatory T cell，Treg)数量并下调辅助性T细胞(helper T cell，Th)l，Th2，Th17数量的作用。笔者拟对mTOR分子结构及其信号通路，mTOR参与免疫细胞的调控以及mTOR抑制剂治疗AIHA等方面进行综述如下。
mTOR基因位于1号染色体短臂(1p36.2)，由2 549个氨基酸组成的丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶，能与雷帕霉素-FK506复合物结合而被命名。mTOR的不同结构域与不同蛋白结合，在细胞内可形成2种不同主要复合物，即哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物(mechanistic target of rapamycin complex，mTORC)1和mTORC2。mTORC1包括mTOR，支架蛋白Raptor (regulatory-associated protein of TOR)，哺乳动物SEC13致死蛋白(mammalian lethal with SEC13 protein，mLST)8，含有与mTOR相互作用蛋白的Dep结构域(Dep domain containing mTOR interacting protein，Deptor)和40 kD的富含脯氨酸蛋白激酶B底物蛋白(proline-rich Akt substrate of 40 kD，PRAS40)。mTORC2包括mTOR，不依赖雷帕霉素的mTOR蛋白(Raptor-independent companion of mTOR，Rictor)，Deptor，mLST8，Proctor-1以及哺乳动物应激激活蛋白激酶相互作用蛋白(stress activated protein kinase-interacting protein，mSin) 1[2]。
mTOR通过mTORC1和mTORC2调控细胞生长、增殖和代谢过程，mTOR的上游信号通路主要包括PI3K/Akt/mTOR和LKB1/AMPK/TSC/mTOR信号通路。细胞外信号如生长因子，T细胞受体(T cell receptor，TCR)和细胞因子等可激活磷脂酰肌醇3-激酶(phatidylinositol-3 kinase，PI3K)，产生第二信使三磷脂酰肌醇(3-phosphoinositide，PIP3)。PIP3与细胞内磷酸肌醇依赖性蛋白激酶(phosphoinositide dependent kinase，PDK)1结合，促使蛋白激酶B(protein kinase B，PKB/Akt)的Ser308磷酸化，活化Akt。活化的Akt可通过以下2种方式激活mTORC1：①活化的Akt可直接磷酸化mTORC1的Ser2448位点，激活其下游信号通路；②活化的Akt促使结节性硬化复合物(tuberous sclerosis complex，TSC)1/2磷酸化，抑制TSC1/2对Ras蛋白脑组织同源类似物(Ras homolog enriched in brain，Rheb)的负向调控作用，并促使Rheb-GTP的积累，导致mTORC1活化。LKB1/AMPK/TSC/mTOR信号通路在免疫细胞的能量代谢方面发挥重要作用，LKB1与AMPK的结合促使AMP-相关活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)磷酸化。AMPK是细胞能量感受器，当细胞内ATP/AMP降低时，AMPK被激活，使TSC2磷酸化，促使TSC2对mTORC1负向调控，从而间接抑制mTOR的活性。mTOR的下游信号通路主要为4E-BP1信号通路和P70S6K信号通路。mTORC1的激活导致P70S6K (70-S6 kinase)和真核细胞翻译起始因子4E结合蛋白(eukaryotic initiation factor 4E-binding protein，4E-BP)1磷酸化，调节下游蛋白翻译及表达，从而调控细胞生长及能量代谢等生理过程。
mTORC2的上游信号通路主要为活化的PI3K与核糖体结合激活mTORC2，其具体发生机制目前尚不清楚。Kazyken等[3]在培养肝脏细胞过程中发现，AMPK磷酸化可直接激活mTORC2和下游信号传导。Yang等[4]研究结果显示，PDK1促使Akt的Thr308磷酸化，活化的Akt促使mSin1 T86处磷酸化，从而激活mTORC2。mTORC2活化后，使Akt(Ser473)磷酸化，激活糖皮质激素调节激酶(serine/threonine-protein kinase，SGK) 1和蛋白质激酶(protein kinase，PK)C。另外，叉头框转录因子O亚家族蛋白(forkhead box O，FOXO)1的磷酸化和失活依赖mTORC2。
树突状细胞(dendritic cell，DC)，T细胞和B细胞功能及活性在AIHA中均发挥重要的作用[5]。mTOR对B细胞、T细胞和DC的活性均有影响[6,7]。雷帕霉素(mTOR抑制剂)结合12 kDa FK506结合蛋白(12 kDa FK506-binding protein，FKBP12)形成雷帕霉素-FKBP12复合物，结合mTOR并抑制mTORC1的形成，延长雷帕霉素治疗也可降低mTORC2活性。
B细胞是产生自身抗体的主要免疫细胞，AIHA患者的B细胞数量明显增高，并且处于活化状态[8,9]。B细胞中，除CD5－B细胞可以合成和分泌自身抗体外，CD5＋B细胞还可以通过分泌白细胞介素(interleukin，IL)-10发挥免疫调节功能。mTOR则通过参与B细胞的生长、发育、代谢，以及高亲和力抗体的产生，参与AIHA的发生。
mTOR主要调控B细胞的生长、发育和代谢。Zhang等[10]通过条件性敲除小鼠CD19＋B淋巴细胞中mTOR构建小鼠模型的研究结果显示，小鼠骨髓中B细胞或脾脏中T1过渡期B细胞数量未存在显著差异，但是脾脏中成熟、T2过渡期和边缘区B细胞的数量均较低，并且淋巴结中B细胞数量亦显著减少；在用硝基苯-鸡γ球蛋白(nitrophenyl-chicken gamma globulin，NP-CGG)免疫后，该小鼠模型形成生发中心、产生高亲和力的抗NP特异性抗体能力降低。Iwata等[11]研究发现，小鼠B细胞的发育过程中，条件性清除mTORC1中Raptor可导致前B细胞存活和增殖水平显著降低，并且发育阻滞、相应外周B细胞缺乏，以及特异性抗体产生减少。另外，缺乏mTORC2可影响B细胞的发育。Lazorchak等[12]研究结果显示，在骨髓中，大量清除mTORC2中mSin1蛋白的B细胞处于祖B细胞(pro-B cell)阶段，使产生免疫球蛋白(immunoglobulin，Ig)M的B细胞的比例和数量减少。B细胞的早期发育需要FOXO1的参与，FOXO1的磷酸化和失活则依赖于mTORC2的活化。缺乏PDK1的祖B细胞Akt(Thr308)和FOXO1磷酸化降低，导致祖B细胞发育阻滞[13,14]。这提示，PDK1和mTORC2对Akt的双重磷酸化是正常B细胞发育所必需。mTOR通过降低外周B细胞数量减少产生自身抗体的效应细胞抑制AIHA发病。
B细胞的激活中，葡萄糖摄取和糖酵解过程均依赖于mTOR信号通路。Raptor缺乏的前B细胞在氧化磷酸化和糖酵解水平较未缺乏者显著降低[11]。这表明，B细胞中mTOR信号的丢失显著降低B细胞的代谢能力，抑制AIHA患者B细胞产生自身红细胞抗体。
T细胞分为Th，Treg及细胞毒性T细胞(cytotoxic T cell，CTL)。其中，Th1可分泌γ干扰素，肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)及IL-2等细胞因子，并且可增强吞噬细胞介导的抗感染免疫。Th2分泌细胞因子IL-4、-5、-6、-10、-13，促进B细胞增殖、分化及抗体的产生，诱导并促进B细胞介导的体液免疫应答。Th17分泌IL-17A，参与AIHA的发生。滤泡辅助性T细胞(follicular helper T cells，Tfh)的数量与功能异常则可能导致AIHA的发生。CD4＋CD25＋Foxp3＋Treg分泌IL-10通过负向调节参与自身免疫平衡[5]。
在不同因素作用下，Th可以极化为Th1、Th2、Th17、Th9、Th22及Tfh等。其中Th1、Th2、Th17及Tfh的失调与AIHA等疾病的发生、发展密切相关[5]。Delgoffe等[16]研究结果显示，一方面，在体内、外，缺乏Rheb的T细胞不能向Th1和Th17极化，但是可保留向Th2极化的能力；另一方面，mTORC2和Rictor的缺乏削弱了向Th2极化，但保留成为极化为Th1和Th17的能力。也有研究发现，mTORC1在Th2极化中的作用更为突出。Zhang等[17]在体外刺激纯化小鼠的CD4＋CD25－T细胞的研究结果证实，雷帕霉素在体外抑制T细胞向Th17的极化。Th17的发育和分化依赖于mTOR信号通路下游的低氧诱导因子(hypoxia inducible factor，HIF)-1α调控的糖酵解。雷帕霉素能抑制Th17的糖酵解，并抑制葡萄糖转运蛋白(glucose transporters，GLUT)1和己糖激酶(hexokinase，HK)2的表达，也抑制c-Myc和HIF-1α转录因子的表达。因此，mTORC1和mTORC2在Th极化中起着重要作用。
Tfh是以表达CXC基序趋化因子受体(C-X-C motif chemokine receptor，CXCR)5为特征的T细胞，调控B淋巴细胞向分泌Ig的浆细胞的转化。Hao等[18]采用急性淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(acute lymphocytic choroidal plexus meningitis virus，LCMV)感染的小鼠模型的研究结果显示，mTORC2结合TCR和诱导性刺激分子(inducible costimulatory molecule，ICOS)介导的共刺激，促进病毒特异性Tfh的后期分化和功能成熟。Yang等[19]对敲除CD4＋T细胞中mTOR的小鼠模型的研究结果显示，组成和诱导Tfh极化严重受损，导致生发中心B细胞形成和抗体产生缺陷。此外，mTORC1主要促进CD4＋T细胞增殖，达到Tfh极化所需的细胞分裂，而Rictor/mTORC2通过促进Akt活化和转录因子T细胞因子(T-cell factor，TCF)-1表达来调节Tfh极化。总之，mTORC2和mTORC1协同调控T细胞极化，致使生发中心B细胞数量减少、功能下降，抑制AIHA患者B淋巴分泌和产生自身抗体。
Treg是具有免疫抑制功能的一组T细胞。其中CD4＋CD25＋Treg与AIHA的发生、发展相关。缺乏mTOR的T细胞增强果蝇母代对抗十肽麻痹蛋白(drosophila mothers against decapentaplegic protein，Smad)3对抗转化生长因子(transforming growth factor，TGF)-β的活性，促进向Treg极化。高水平的mTOR激活促进T17极化，而低水平mTOR信号传导则促进Treg细胞积累，并且使Treg对TGF-β敏感。Treg和Th17的细胞失衡与许多自身免疫性疾病有关，雷帕霉素在体外抑制Th17的分化，促进Treg细胞的产生[17]。雷帕霉素促进Treg脂肪酸氧化代谢，随着脂肪产物β-羟基丁酸水平的升高，Treg中脂肪酸的关键酶脂肪甘油三酯脂肪酶(adipose triglyceride lipase ，ATGL)和肉毒碱棕榈酰基转移酶(carnitine palmitoyl transferase，CPT)1A的表达水平增加，雷帕霉素也促进Treg细胞中脂肪酸调控的关键信号磷酸化AMPKα水平升高。
根据细胞来源、表型特点和功能，DC可以分为髓样DC(myemoid DC，mDC)和浆细胞样DC(plasmacytoid DC，pDC)。邢莉民等[20]研究结果显示，AIHA患者外周血DC数量较高，以mDC数量增多为主。这提示AIHA的发病可能与DC相关，而DC增多可以导致机体免疫失衡、初始T细胞被激活，产生免疫毒性T细胞，同时活化B细胞产生自身抗体，导致免疫炎症反应。Lin等[21]使用共聚焦显微镜动态观察小鼠淋巴结中DC-T细胞接触，以利用DC形态学表征来观察mTOR抑制剂对DC-T细胞接触的作用效果，该结果显示，雷帕霉素改变DC的形态，而形态改变的DC与T细胞的接触率降低。但是，mTOR如何在体内调控DC-T细胞接触，目前尚不清楚。另外，DC活化的主要特点为葡萄糖代谢的增加。DC的激活通常是由Toll样受体(Toll-like receptors，TLR)与微生物相关配体的相互作用启动。通过TLR活化的DC有氧糖酵解明显提高，从而调控人和小鼠DC的免疫功能。在不表达诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)的DC中，持续糖酵解重编程依赖于mTOR和其下游转录因子HIF-1α。在iNOS表达的DC中，mTOR抑制剂降低了DC中一氧化氮(nitric oxide，NO)产生，恢复线粒体功能，从而提高细胞的代谢能力、增加细胞炎症活性[22]。去除TORC2的mDC炎症活性增强，提高了对T细胞刺激活性，但具体机制尚不清楚。Watson等[7]研究发现，小鼠来源的TORC2缺陷mDC可利用更改的代谢途径，提高基础糖酵解，提示TORC2缺陷mDC能够代偿性提高TORC1通路活性，活化Akt/TORC1信号通路，因此该研究者认为，TORC2限制mDC中TORC1驱动的细胞代谢活性和对线粒体的调控。AIHA患者mDC数量增高，但mDC的功能状态尚未完全明确，其糖代谢水平如何有待于进一步研究。
根据是否存在基础疾病，AIHA可分为原发性和继发性AIHA，mTOR抑制剂首先被应用于实体器官移植(solid organ transplantation，SOT)后的继发性AIHA。SOT后并发AIHA是由受体淋巴细胞对受体红细胞抗原产生的IgG或IgM引起。其中，儿童SOT受者的AIHA发生率高达10%～15%[23,24]。钙调神经磷酸酶抑制剂(calcineurin inhibitor，CNI)是SOT患者的首选免疫抑制药物。CNI特异性结合抑制钙调神经磷酸酶(calcinurin，CN)抑制T细胞的成熟，Treg依赖性B细胞的活化，以及IL-2、-3及γ干扰素等细胞因子的生成，导致T细胞亚群不平衡，尤其Treg细胞，而Treg与移植后B细胞调节和抗体产生息息相关[25]。长期使用CNI对T细胞免疫功能的改变，在AIHA的发病机制中发挥重要作用[26]。mTOR抑制剂可诱导异常淋巴细胞凋亡，上调具有免疫负性调控作用的Treg分泌IL-10和TGF-β水平，可以抑制效应性T细胞和其他免疫细胞的过度激活，限制自身免疫性病程进展，诱导SOT后部分AIHA患者获得完全缓解(complete remission，CR)。
Acquazzino等[27]报道4例小肠、肝脏和胰腺联合移植后婴幼儿，其均使用CNI、环孢素等抑制实体器官移植后的排斥反应。该研究结果显示，4例患儿均出现直接抗人球蛋白试验(direct antiglobulin test，DAT)阳性AIHA，经过西罗莫司(sirolimus)治疗后溶血缓解。通过对11例移植后患者随访，发现中断CNI治疗、开始西罗莫司治疗后，AIHA病情好转。Park等[1]对54例SOT后AIHA患者进行的回顾性分析结果显示，21例SOT后AIHA患者接受西罗莫司治疗，>80%的患者溶血得以持续控制。3例患者在使用西罗莫司后出现伤口愈合不良、肾病综合征以及机会性感染，然而，患者同时接受过其他免疫抑制治疗，雷帕霉素与机会性感染之间的因果关系，有待进一步明确。
mTOR抑制剂在难治/复发性AIHA中也有应用。刘清池等[28]观察了雷帕霉素治疗28例复发性AIHA患者的疗效，结果显示，经过泼尼松、环孢素等多种药物治疗后复发的AIHA患者应用雷帕霉素治疗，有效率为78.6%(18/22)，停药后胆固醇、甘油三酯升高，口腔黏膜溃疡，血压升高等不良反应消失。雷帕霉素治疗AIHA有较好疗效，对一些应用糖皮质激素、环磷酰胺、环孢素治疗不良反应大、难以维持的患者，不失为一种安全有效的选择。另外，自身免疫性淋巴细胞增生综合征(autoimmune lymphoproliferative syndrome，ALPS)是一种以Fas信号缺陷为特征的人类疾病，可导致慢性良性淋巴增生和TCRαβ＋CD4－CD8－双阴性T细胞(double negative T cell，DNT)过度增殖，以mTOR为靶点的雷帕霉素在体内抑制DNT细胞的增殖和异常分化，为应用于ALPS的治疗提供了重要的理论依据[29]。雷帕霉素单药治疗ALPS患者的多中心前瞻性临床试验中有较好的治疗数据[30]。
AIHA属于自身免疫性血细胞减少症，其免疫发病机制迄今尚未完全阐明。目前，该病的治疗药物主要是免疫抑制剂，如糖皮质激素、环磷酰胺、环孢素等，但长期应用广谱免疫抑制剂，容易导致严重感染，并且部分患者在免疫抑制剂停药时可出现病情反复。mTOR抑制剂作用于mTOR信号通路，起到上调Treg数量，并下调Thl、Th2、Thl7数量的作用，具有一定分子靶向性，对原发、继发性AIHA均能发挥治疗作用，尤其是对复发/难治性AIHA有一定疗效。但是，mTOR抑制剂治疗AIHA的疗效及药物不良反应，仍需多中心、大样本量的随机对照试验进一步研究、证实。
利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突
