mRNA疫苗技术是近年逐渐发展起来的疫苗新技术之一，其在稳定性、高效投递等方面的技术日趋成熟。mRNA疫苗在细胞内表达抗原，通过刺激免疫系统产生B、T细胞免疫应答等多种效应机制，可达到预防传染病的作用。同时由于其是全合成制备，生产工艺简单，具有快速应对诸如新型冠状病毒感染等突发传染病疫情的潜力。为了解传染病mRNA疫苗的开发与研究现状，本文重点对mRNA疫苗的结构特点、优势和挑战以及应用于传染病疫苗研究的现状进行了综述，为新型冠状病毒等传染病mRNA疫苗的研发提供一定借鉴。
COVID-19正在全球范围内蔓延，给人类生命健康带来了巨大威胁。面对这样的一场突如其来的瘟疫，隔离甚至封城的措施能够起到明显的控制疫情的作用，但是预防并最后控制传染性疾病的有效手段是接种疫苗[1,2]，研发安全有效的疫苗是当务之急。在新型冠状病毒疫情突发又缺乏疫苗的当下，mRNA疫苗技术因其在设计和构建上的快速性和应变性，以及简单的全合成制备和可沿用的生产工艺等优势，具备用于研发应急性疫苗的潜力。本文将综述mRNA技术原理以及其用于流感病毒、狂犬病病毒、埃博拉病毒、寨卡病毒、新型冠状病毒等疫苗的研究进展。
Wolff等[3]在1990年发现，给小鼠肌肉内注射mRNA后，能够检测到其编码蛋白的表达以及针对此抗原的免疫应答，首次揭示了mRNA技术应用于疫苗研究的可能性。后来又有研究者将编码激素的mRNA直接注射至小鼠大脑中，发现其具有缓解尿崩症的作用，说明mRNA不仅能作为预防性疫苗而且具备成为治疗性药物的潜力[4]。
mRNA疫苗是由DNA的一条单链作为模板，体外转录而成，其进入细胞的过程与机体自身的mRNA相反。它是从细胞外进入细胞质，此途径模拟了病毒感染的过程，能有效诱导体液免疫和细胞免疫应答[5]。从结构上，mRNA疫苗可分为普通型和复制型(图1)。
注：Cap：帽子结构；5′UTR：5′端非翻译区；3′UTR：3′端非翻译区；MHC：主要组织相容性复合体
普通型mRNA疫苗的合成通常是以线性化的DNA为模板，利用包括T7、T3或Sp6噬菌体聚合酶在内的RNA聚合酶通过体外转录获得，可对其DNA模板和转录原料进行控制，获得在分子水平上精准设计的产品。普通型mRNA疫苗的结构和修饰包括：5′端帽子结构(5′Cap)、5′端非翻译区(5′untranslated region，5′UTR)、编码蛋白质的开放阅读框(open reading frame，ORF)、3′UTR和1个100～250 bp的多聚腺苷酸尾巴Poly(A)[6]。
mRNA的翻译和稳定性需要功能性的5′端帽子结构，常用的帽子结构为单甲基化的GpppG。帽子结构可通过与EIF4E结合影响mRNA翻译效率，同时加帽后的5′端没有游离的磷酸基团，所以不会被碱性磷酸酶降解，而且帽子结构封闭了磷酸酯键上游离的2′OH基团，因此对RNA酶也很稳定[7]。
UTRs对基因的转录后调节起着非常重要的作用，能影响mRNA的翻译效率、亚细胞定位和稳定性。在α球蛋白3′端加上UTR后，确有稳定mRNA的作用；在β球蛋白的5′端和3′端加上UTR还可以提高翻译效率。例如，在BioNTech公司的专利中，使用了2个β球蛋白串联的3′UTR，显著地增强了mRNA的稳定性，不被降解[8]。此外，建议将终止密码子后的碱基改为G或A，可以更有效地终止翻译，增强蛋白抗原的表达[9]。
另一种稳定RNA分子的方法是在3′端加Poly(A)尾，它是除了5′端加帽结构以外对mRNA稳定性最重要的结构。可以将含Poly(A)尾基因的片段编辑在DNA模板上来加尾，也可以使用重组Poly(A)多聚酶在体外转录完成后延伸mRNA进行加尾。但利用重组Poly(A)多聚酶制备出的Poly(A)尾长度不一。相比之下，利用DNA模板生成的Poly(A)尾具有确定的长度，因此是更好的选择[10]。已经证实增加Poly(A)尾的长度可以提高形成多聚体的效率，同时也会影响蛋白抗原表达的水平。据研究报道，最适宜的Poly(A)尾长度在120～150个核苷酸之间[11]。
基因序列中的密码子会影响蛋白抗原的翻译效率，将使用频率高的同义密码子替换稀有密码子可提高翻译效率[12]，因为反复使用相同的转运RNA(tRNA)可以加速翻译[13]。如有些蛋白抗原需要被缓慢释放，可以采用缓慢的翻译策略，选择使用稀有密码子。
普通型mRNA疫苗的ORF只含有编码抗原的基因，但复制型mRNA疫苗的ORF不仅包含编码抗原的基因，还包括RNA扩增需要的非结构蛋白(nonstructural proteins, nsPs)基因，可以使进入细胞的mRNA疫苗进行自我扩增，增加目的抗原蛋白的表达量[14]。目前使用的复制型mRNA疫苗大多基于甲病毒基因组[15]。甲病毒属于单股正链RNA病毒，其中靠近5′端的非结构区编码P1～P4共4种nsPs，靠近3′端的结构区编码病毒的结构蛋白。在病毒进入细胞后nsPs基因首先被翻译，产生RNA复制所需的nsPs，可以让RNA分子快速扩增并被大量翻译成蛋白质[15]。复制型mRNA疫苗中的抗原基因是编码病原微生物保护性抗原的结构基因，保留了UTRs和nsPs基因，以实现抗原蛋白的高效表达。
给动物直接注射mRNA能够通过表达特定蛋白质，诱导免疫应答，发挥类似疫苗的作用[16]。但是受当时的技术限制，在mRNA的稳定性、投递和安全性等方面存在瓶颈，被认为可应用性较差，使得mRNA技术逐渐趋冷，进展缓慢[17,18]。从21世纪初开始，mRNA合成、修饰和投递技术的发展逐渐让mRNA技术重返生物制药公司的视线[19]。
mRNA疫苗被注入机体进入细胞后，在细胞质中翻译，无需进入细胞核，因此没有整合宿主基因组的风险。在制备或生产mRNA疫苗的过程中，因为不需要细菌或细胞培养[20]，污染微生物的风险很低。
mRNA疫苗能通过MHCⅠ类和MHCⅡ类两种分子途径进行抗原提呈，因此可同时诱导体液与细胞免疫应答。mRNA还具有激活免疫应答的佐剂作用[21]。研究发现，mRNA作为佐剂可通过Toll样受体(TLR)等识别方式，刺激免疫细胞分泌TNF-α和IFN-γ等细胞因子[22]，调节免疫应答。
mRNA疫苗制备技术采用的是全合成，可以沿用相似的生产工艺和同样的仪器设备来生产不同的mRNA疫苗品种，因此其研发周期短、成本低、易标准化生产[22,23]。2013年发生的H7N9禽流感疫情中[24]，在血凝素(HA)基因序列发布后的第8天，就完成了mRNA疫苗的设计和构建[25]，进入快速制备阶段。该特点适用于传染病暴发时的灵活应对，相对简单的生产工艺也便于质量控制[25]。
mRNA疫苗本身不稳、易降解。除了通过对5′UTR和3′UTR区域序列的改进、合成类似"帽子"的结构及修饰多聚A尾巴等提高mRNA稳定性以外[26,27,28]，更多采用高效的mRNA投递方法避免其降解[2,3]。投递载体可显著改善mRNA疫苗的稳定性和翻译效率。常用的投递载体可分为病毒载体和非病毒载体。某些单链RNA病毒，如甲病毒属、黄病毒和仙台病毒等都可用于mRNA的投递，但病毒载体由于本身具有免疫原性，限制了其应用。非病毒载体是投递mRNA疫苗的有效手段，包括树突状细胞、鱼精蛋白、高分子载体和脂质纳米粒(lipid nanoparticles, LNPs)等[29]。LNPs主要由4个部分组成：可电离的阳离子脂质、脂质连接的聚乙二醇(PEG)、胆固醇和天然存在的磷脂。可电离的阳离子脂质促进mRNA自主聚集成病毒大小的颗粒(约100 nm)和mRNA在细胞质中的释放；PEG延长了复合物的半衰期；胆固醇作为一种稳定剂，可以提高复合物的稳定性；磷脂能帮助形成脂质双层结构。LNPs已经成为mRNA疫苗常用的载体，广泛应用于基于mRNA的癌症免疫治疗和预防病毒感染的疫苗等领域[30]。与其他许多投递系统相比，纳米粒的配方具有许多优点，如易于制造、批次间稳定性高、良好的生物相容性和可扩展性。此外，一些脂质体和多聚体可以通过与化学反应基团结合而很容易地与配体功能化，用于特定的细胞或组织的投递[31]。
安全有效的疫苗，既能诱导出特异性的免疫应答，也必须避免免疫过激对人体造成免疫损伤。mRNA疫苗是外源性的核酸分子，与体内自然产生的mRNA完全不同。进入机体的外源性RNA会被体内不同类型免疫细胞上的受体识别，例如树突状细胞、巨噬细胞和淋巴细胞等，从而诱导免疫应答，促进免疫细胞分泌干扰素等细胞因子。在先前预防流感病毒和狂犬病毒mRNA疫苗的临床试验中观察到了局部和全身的不良反应(adverse events, EVs)[32,33]。为了保证mRNA疫苗的安全性，使用核苷类似物如甲基胞苷等手段，使得Toll样受体不再被激活，在提高mRNA稳定性的同时，能有效地控制mRNA引起的免疫过激反应[15]。
采用mRNA技术来研发传染病的预防性疫苗，已经在病毒、细菌和寄生虫等传染病方面取得了进展。有些mRNA疫苗在临床前研究中显示出比传统疫苗更好的免疫保护效果。
1993年研究发现mRNA疫苗能在小鼠体内表达流感病毒的核蛋白(NP)[34,35]。但是直到2012年，才初次证实该疫苗能够在小鼠、雪貂和家猪中诱导出与灭活流感疫苗同样强度的抗体反应，证明了mRNA疫苗对动物的免疫保护效果[19,28]。Pardi等[28]在H1N1流感病毒mRNA疫苗的研究中，采用了小鼠、家兔和非人灵长类动物模型，不论采用皮内注射还是肌肉注射，均能诱导产生高水平的血凝素抑制性(hemagglutination inhibition, HAI)抗体。尤其是在非人灵长类动物中诱导产生了高效价的HAI抗体，甚至高于已上市的灭活流感病毒疫苗对照组[34,35]。另外，免疫接种H1N1流感病毒mRNA疫苗后，能够产生交叉免疫保护，实验动物能够抵抗H5N1流感病毒攻击[34,35]。
在一项临床试验研究中，对23名健康受试者进行2次肌肉注射H10N8流感病毒mRNA疫苗，在第2次接种后的第3周，全部受试者体内产生了≥1∶40的HAI抗体，87%产生了≥1∶20的病毒中和抗体[35]。在另外一项临床试验中，低剂量组受试者肌肉注射2次H7N9流感病毒mRNA疫苗，在第2次接种后的第3周，有96.3%的志愿者体内产生了≥1∶40的HAI抗体；100%疫苗接种者产生了≥1∶20的病毒中和抗体；而高剂量组受试者中，有89.7%体内产生了≥1∶40的HAI抗体；96.6%接种者产生了≥1∶20的病毒中和抗体[35]。同样的流感病毒mRNA疫苗在两个不同的临床试验中，均显示出疫苗在人体内相似的免疫原性，但是与临床前的动物试验结果相比，抗体的水平则低很多。
临床前动物试验结果显示，对小鼠和家猪模型皮内注射编码狂犬病毒糖蛋白G的mRNA疫苗，均能够诱导出抗原特异性的免疫应答，产生具有免疫保护水平的病毒中和抗体[36]。研究者通过进一步改用脂质体包裹mRNA后投递至小鼠或非人灵长类动物，结果能在动物体内诱导出持续时间更久的中和抗体反应[36]。
德国CureVac公司用编码狂犬病毒糖蛋白G的mRNA疫苗开展了临床试验[33]。在该临床试验中，免疫接种使用常规注射或无针注射。在所有常规针头注射器接种的受试者体内，均未检出特异性的抗体免疫应答。而在无针注射法接种的受试者体内，均能诱导出抗体反应，但持续时间不长。所有受试者在接种疫苗的7 d内，注射局部出现轻度或中度不良反应，78%的受试者产生了全身性的不良反应，包括发热、疲乏和疼痛。CureVac公司在2018年开展了第二次狂犬病毒mRNA疫苗的Ⅰ期临床试验，至今尚未报道试验结果。
2014年2月暴发于西非的埃博拉疫情造成了一万多人的死亡。Ⅲ期临床试验证实了水疱性口炎病毒载体埃博拉疫苗(VSV-EBOV)的免疫保护效果，但是病毒载体在人体中诱发严重的不良反应。
然而，在编码埃博拉病毒糖蛋白(GP)的mRNA疫苗临床前研究中，采用小鼠或者豚鼠模型肌肉内注射2次后，均能诱导动物体内产生体液和细胞免疫应答，抵抗致死剂量的埃博拉病毒的攻击。所有接种了mRNA疫苗的动物均没有发生体重减轻、体温升高和死亡，获得了100%的免疫保护效果[37]。由于埃博拉病毒疫情已经被控制，后续没有见到相关的mRNA疫苗临床试验的报道。
2015年5月，寨卡病毒疫情在中、南美洲开始暴发流行，在这期间发现一些新生儿先天性畸形和小头畸形的发生可能与感染寨卡病毒有关。临床前的动物试验显示了编码寨卡病毒跨膜蛋白E的mRNA疫苗能诱导产生有效的免疫应答。在编码寨卡病毒跨膜蛋白E的mRNA疫苗临床前研究中，小鼠肌肉注射2次mRNA疫苗，低、高剂量组均能诱导出高效价的E蛋白抗原特异性抗体，并能抵抗致死剂量的病毒攻击，抗体反应从免疫后的第8周维持到第12周；而恒河猴皮内单次注射mRNA疫苗，特异性的抗体效价在免疫后的第4周可以达到峰值，并能维持8周[38]。临床前研究还发现，寨卡病毒mRNA疫苗在小鼠体内诱导的免疫应答对其他虫媒病毒，例如登革热病毒、波瓦萨病毒均具有交叉免疫保护效果[38]。美国的Moderna公司于2019年2月宣布了寨卡病毒mRNA-1325疫苗的临床试验计划。
目前基于mRNA技术进行的新型冠状病毒疫苗研究大多处于临床前阶段，已经批准进行临床试验的也未正式披露完整的研究数据。Moderna公司是最早进行新型冠状病毒mRNA疫苗研发的机构之一，该机构新型冠状病毒疫苗mRNA-1273的临床前小鼠试验数据显示，该疫苗可以诱导有效的中和抗体以及CD8 T细胞反应，并且可以保护小鼠免受新型冠状病毒感染，其已经被批准进入临床试验研究[39]。Ⅰ期临床试验第一阶段招募受试者45人，分低(25 μg)、中(100 μg)、高(250 μg)3个剂量组，受试者以28 d间隔接受2次疫苗肌肉注射[40]。临床试验结果显示，初次免疫后的第15天，不同疫苗剂量组的受试者体内均诱导产生了抗体[41]。第2次加强免疫后，低剂量组(25 μg)受试者体内产生的中和抗体水平与COVID-19康复者相当，而中剂量组(100 μg)受试者在加强免疫后的第2周，体内中和抗体水平显著超过COVID-19康复者[41]。该疫苗目前已进入Ⅲ期临床试验。
除此之外，BioNTECH公司新型冠状病毒mRNA疫苗BNT162的临床试验申请已经获得德国卫生部和疫苗审批机构保罗·埃尔利希研究所的批准，将招募200名18～55岁的健康志愿者接种mRNA疫苗进行Ⅰ期临床试验，观察疫苗的安全性[42,43,44]。该试验第一阶段共招募45名18～55岁受试者入组，分为低(10 μg)、中(30 μg)和高(100 μg)3个剂量组。研究结果显示接种疫苗后21 d，不同剂量组的受试者均诱导产生了RBD抗体，抗体在28～35 d达到峰值，中和抗体滴度比COVID-19康复患者的中和抗体滴度高1.8～2.8倍。目前BNT162正在开展Ⅱ/Ⅲ期临床试验[45]。CureVac公司研发的新型冠状病毒mRNA疫苗CVnCoV已经完成了临床前研究，目前正在开展Ⅰ/Ⅱ期临床试验，暂时未有临床试验数据披露[41,42,46,47]。斯微(上海)生物科技有限公司与中国疾病预防控制中心以及上海同济大学医学院等单位合作研发了新型冠状病毒mRNA疫苗SW0123，该疫苗携带新型冠状病毒关键靶点多种不同抗原序列，通过纳米脂质(LPP)载药技术制备成制剂，并通过动物试验等验证了有效性和安全性，正在临床试验申报和审批中[41,42]。军事科学院军事医学研究院研发的新型冠状病毒mRNA候选疫苗(ARCoV)通过了国家药品监督管理局临床试验批准，是我国首个获批启动Ⅰ期临床试验的新型冠状病毒mRNA疫苗，将率先在树兰(杭州)医院开展临床研究，目的是评价不同剂量新型冠状病毒mRNA疫苗在18～59岁、60岁及以上人群中接种的安全性、耐受性及初步免疫原性[48]。此外，赛诺菲、杜克-新加坡国立大学医学院等其他几个科研团队或企业正在进行新型冠状病毒mRNA疫苗研发，目前大多处于药物筛选和动物试验阶段[42]，其中杜克-新加坡国立大学医学院研发的新冠mRNA疫苗ARCT-021正在开展Ⅰ/Ⅱ期临床试验[49]。
正常的疫苗研发过程在临床前要通过动物模型筛选多个候选疫苗，并在动物模型中验证有效性和安全性以后才能开展临床试验，而Moderna公司的新型冠状病毒疫苗mRNA-1273未遵循疫苗研发常规流程，未做完整的动物试验就直接开展临床试验[40]，这是需要重点关注和深入思考的。在疫情暴发紧急状态下，对疫苗临床前安全性和有效性如何快速评价，尽早推向临床试验是个挑战性问题。
另外，在当前不断演变的疫情新形势下，如何快速和高效地开展疫苗免疫保护效力评价的Ⅲ期临床试验也是当前面临的重要问题。哈佛大学公共卫生学院和伦敦卫生与热带医学学院的研究人员呼吁绕开传统的Ⅲ期临床试验相关流程，开展人类挑战试验(human challenge trials, HCT)，即将健康的志愿者暴露于新型冠状病毒之下，观察接种了疫苗的受试者能否抵抗感染[50]。基于此问题，世界卫生组织于2020年5月6日公布了"新型冠状病毒肺炎人类挑战性研究的伦理可接受性关键准则"，提出了考虑HCT时需要满足的8个条件，即疫苗的科学依据、潜在的利弊评估、公众和专家的认可、政府指导和药监局的监管、实验场所的临床医疗保障、受试者的选择标准、独立和有资质的评估机构、充分告知试验的风险。当然，WHO也在其中反复强调，只有在没有其他有效疗法可治愈的疾病和没有可用疫苗预防的突发传染病时，才会考虑采用人体挑战试验[51]。
mRNA是一种全新的疫苗技术，具有通用度高、效力高、构建快、易扩大生产和不需冷链运输等优点。更重要的是，由于mRNA疫苗在设计、构建和生产上的应变性和快速性，可以迅速应对和解决突发的大范围流行传染病与有效疫苗供应之间的矛盾。但至今mRNA疫苗研究大部分处于临床前或临床Ⅰ/Ⅱ期研究阶段，还没有被批准上市的mRNA疫苗产品，这是其研发中存在的短板。因此在快速推进新型冠状病毒mRNA疫苗研发的同时，要慎重测试和研究疫苗的安全性和有效性，动物试验结果不能完全代表人体试验。随着mRNA技术研究的发展、投递介质和技术的改进以及更多临床试验的研究进展，可以预期在未来预防突发传染病的新型疫苗中，mRNA疫苗将会发挥更大潜力。
