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肌细胞增强子2（myocyte enhancer factor 2，MEF2）属于MADS超家族，其蛋白N端都具有一个保守的MADS盒和MEF结构域序列，包含MEF2A、MEF2B、MEF2C和MEF2D 4个家族成员[1]。其中，MEF2C是一种重要的转录因子，其编码基因位于染色体5q14.3，在不同的转录复合体中呈现不同程度的表达，在骨骼肌和心肌的分化发育过程中起重要作用[2,3,4]。近年来研究发现在急性T淋巴细胞白血病患者中存在MEF2C基因重排和表达水平的异常，并对白血病的发病起重要作用[5,6,7]。为进一步了解MEF2C基因在急性髓系白血病（AML）中的作用，我们检测了67例初发成人AML患者MEF2C mRNA的表达水平，以探讨其临床意义。
2009年7月至2013年7月就诊于苏州大学附属第一医院血液科经MICM分型确诊的67例初发成人（≥14岁）AML（M3除外）患者，其中男39例，女28例，男女比为1.39∶1，中位年龄41（17~77）岁，52例（77.6%）患者初发时骨髓白血病细胞>0.800。AML的诊断和疗效判定符合《成人急性髓系白血病（非急性早幼粒细胞白血病）中国诊疗指南（2017年版）》标准[8]。根据FAB分型：M0 1例、M1 19例、M2 23例、M4 9例、M5 14例、M6 1例。全部患者均在我中心进行至少1个疗程以上的治疗，初次诱导采用IA或DA（去甲氧柔红霉素/柔红霉素+阿糖胞苷）标准化疗方案，获得完全缓解（CR）后根据危险度分层进行巩固治疗，低中危患者以中高剂量阿糖胞苷为主的方案巩固治疗3~4个疗程或行自体造血干细胞移植，有合适供者的高危组患者在巩固治疗1~2个疗程后行异基因造血干细胞移植。收集上述患者初诊时冻存骨髓单个核细胞（BMMNC）标本，同时留取12例健康志愿者骨髓液作为正常对照。资料和标本的获得征得研究对象知情同意，研究经苏州大学附属第一医院医学伦理委员会批准。
MEF2C和GAPDH荧光定量PCR探针购自美国Applied Biosystems公司，Ficoll淋巴细胞分离液、TRIzol试剂盒、逆转录试剂盒均购自大连宝生物工程有限公司，PCR Master Mix购自美国Promega公司，7500型实时荧光定量PCR（RQ-PCR）仪为美国Applied Biosystems公司产品。
取患者骨髓2~5 ml，肝素抗凝，用Ficoll淋巴细胞分离液分离单个核细胞，取（5~10）×106个细胞，按TRIzol试剂盒操作说明书进行操作，提取总RNA，核酸蛋白定量仪检测RNA的质量和浓度，A260/A280比值介于1.8~2.0。
逆转录反应总体积为40 μl：标本总RNA 4 μg，六种随机引物100 ng，5×逆转录缓冲液8 μl，10 mmol/L dNTP 2 μl，RNasin 50 U，M-MLV 30 U。37 ℃ 60 min，95 ℃ 5 min，-20 ℃保存备用。
以GAPDH为内参。反应体系20 μl：5×Buffer 4 μl，Mg2+ 0.24 μl，dNTP 0.6 μl，MEF2C基因荧光定量探针1 μl，Taq DNA聚合酶0.2 μl，cDNA 2 μl，ddH2O 11.96 μl。每个样本设3个复孔，每板均设阴性及阳性对照。反应条件：50 ℃，2 min；预变性95 ℃，10 min；变性95 ℃，15 s；退火60 ℃，60 s；45个循环。荧光收集设置在60 ℃退火阶段。
MEF2C的相对定量结果以2-△Ct公式计算，△Ct=CtMEF2C－CtGAPDH。
随访资料通过查阅病历和电话随访获得，观察患者复发及生存情况。随访截止日期为2015年12月，中位随访26（0.1~77）个月。无事件生存（EFS）时间定义为自患者确诊之日起至化疗失败、复发、死亡或末次随访日期，总生存（OS）时间定义为自确诊之日起至患者死亡（任何原因）或末次随访日期。
数据采用SPSS 16.0软件进行统计分析。计量资料的组间比较使用独立或相关的秩和检验，数据以中位数（最小值~最大值）表示；率的比较，采用Fisher确切概率法。生存的评估采用Kaplan-Meier生存分析，组间比较采用Log-rank检验。以P<0.05为差异有统计学意义。
AML组MEF2C mRNA的中位表达水平为18.22（0.42~137.04）×10-3，而正常对照组MEF2C mRNA的中位表达水平为3.03（0.71~14.07）×10-3，AML组明显高于正常对照组（z=-4.48，P<0.001）。以MEF2C mRNA中位数为分界点，分为高表达组（MEF2C≥18.22×10-3）和低表达组（MEF2C<18.22×10-3），两组MEF2C中位表达水平分别为28.25（18.22~137.04）×10-3与8.89（0.42~18.21）×10-3。高表达组中初发时WBC≥100×109/L患者比例（9/34，26.5%）高于低表达组（5/33，15.2%）（P=0.369）。高表达组患者初发时的中位骨髓原始细胞比例为0.725（0.250~0.980）、中位HGB水平为78（38~125）g/L、中位PLT为29（8~229）×109/L，而低表达组分别为75%（24.5%~96.5%）（z=-0.164，P=0.870）、80（44~127）g/L（z=-0.132，P=0.895）和30（7~137）×109/L（z=-0.195，P=0.846），差异均无统计学意义。
为了解MEF2C mRNA表达水平的动态变化，对14例初发时MEF2C高表达组AML患者进行了初发和CR时骨髓中该基因表达水平的检测。结果显示，该14例患者初发时MEF2C mRNA的相对表达量为34.10（14.61~99.91）×10-3，高于CR时MEF2C基因的相对表达水平13.04（2.91~45.19）×10-3（z=-3.233，P<0.001）。此组AML病例随访14~45个月，其中5例本病复发，复发时BMMNC MEF2C mRNA的中位表达水平为37.25（12.89~65.61）×10-3，与CR时相比有明显上升。其中3例在临床复发前1~3个月即监测到该基因的转录本呈现上升趋势。
M1型组AML患者MEF2C基因mRNA中位表达水平为23.17（0.42~61.59）×10-3，M2型组为11.93（1.86~51.59）×10-3、M4型组为23.43（10.68~34.79）×10-3、M5型组为18.69（2.21~137.04）×10-3。M5型组AML患者MEF2C基因mRNA的表达水平与非M5型组[18.21（0.42~61.59）×10-3]差异无统计学意义（z=1.145，P=0.252）。
按染色体核型进行分组，正常核型组患者36例，伴有t（8;21）和inv（16）异常合为CBF-AML组患者14例，其他异常核型组17例，包括-Y、+8、t（6;11）等。上述三组AML患者MEF2C mRNA表达水平分别为17.41（0.42~99.91）×10-3、22.10（6.56~51.59）×10-3、10.99（2.20~137.04）×10-3，组间比较差异无统计学意义（K=0.730，P=0.694）。
67例初发AML患者接受至少1个疗程的化疗。MEF2C高表达组CR率为76.47%（34例中26例），与低表达组[84.84%（33例中28例）]比较差异无统计学意义（P=0.539）。67例AML患者中有15例治疗后失访，无法评估生存情况。对其余的52例患者进行生存分析，结果显示MEF2C高表达组和低表达组的3年EFS率分别为18.8%和49.2%（χ2=3.201，P=0.079），3年OS率分别为（19.4±10.5）%和（49.2±17.4）%（χ2=3.024，P=0.094），差异均无统计学意义。然而进一步以染色体核型为变量作亚组分析，在12例CBF-AML患者中，MEF2C高表达组和低表达组的3年EFS率分别为28.6%和49.8%，3年OS率分别为（20.0±14.6）%和（51.0±16.2）%；14例其他异常核型患者中，MEF2C高表达组和低表达组的3年EFS率分别为27.7%和45.6%，3年OS率分别为（16.4±12.5）%和（42.4±17.8）%；在26例正常核型AML患者中，MEF2C高表达组和低表达组的3年EFS率分别为18.2%和53.8%（χ2=3.909，P=0.048），差异有统计学意义；3年OS率分别为（17.9±11.3）%和（49.2±15.4）%（χ2=3.276，P=0.070）。
MEF2C基因在骨骼肌、心肌、脑和脾脏中均存在着高表达，不同组织中该基因呈现出不同的异构体[1,2,3,4]。MEF2C蛋白缺失的小鼠会由于早期心血管形成障碍而胚胎死亡[9]；肌源性bHLH与MEF2C蛋白结合对骨骼肌甚至骨形成都有至关重要的作用[10]；此外MEF2C基因的缺失或突变还可造成脑和颅骨发育异常，出现MEF2C单倍体不足相关的神经系统疾病[11,12,13]。MEF2C基因与造血系统也关系密切，在造血细胞的不同分化发育阶段也存在不同程度的表达[5]，尤其在急性T细胞淋巴细胞白血病中，有研究发现MEF2C基因存在异常激活[6,7,14]。我们采用array-CGH的方法曾在2例混合表型急性白血病中发现存在MEF2C基因的微缺失[15]。提示MEF2C在不同类型的白血病发病中可能均存在着重要价值。Laszlo等[16]在儿童AML中发现MEF2C基因高表达者EFS和OS差，而且在预后不良组中差异更明显。而成人AML中MEF2C基因表达的情况及其预后意义在国内外尚无相关报道。
我们采用RQ-PCR技术检测了67例初诊成人AML患者MEF2C mRNA的表达水平，发现AML患者中MEF2C基因普遍高表达。Schuler等[17]和Stehling-Sun等[18]学者曾报道，单核分化的AML患者MEF2C基因表达水平更高，同时在小鼠实验研究中发现MEF2C在促进髓系祖细胞向单核系分化中具有重要意义，而且在不同亚型AML中MEF2C基因的表达存在异质性。但本研究中M5型患者MEF2C基因表达水平与其他亚型差异无统计学意义，有待扩大样本进一步研究。在分析MEF2C基因与部分临床和实验室指标之间的关系时，结果提示MEF2C高表达组AML初发时的WBC≥100×109/L患者比例高于低表达组（26.5%对15.2%），但差异无统计学意义；而高表达与低表达组间在骨髓原始细胞比例、HGB以及PLT均相近。对14例AML患者进行该基因表达水平的动态监测，结果显示患者初发时MEF2C基因表达水平高于其CR时，在达到CR时体内仍残留有不同数目的白血病细胞，MEF2C基因表达水平下降的程度对患者CR质量的评估价值有待进一步研究。随访此组14例AML患者，有5例患者复发，复发时MEF2C基因均呈现相对较高水平的表达，其中3例在临床复发前1~3个月即检测到该基因转录本呈现上升趋势，提示MEF2C基因与AML的发病和疾病状态有一定相关性。
我们进一步分析了MEF2C基因表达水平与AML临床疗效及预后的关系，结果显示MEF2C基因高表达组CR率偏低于高表达组。在总体AML及不同核型亚组中均观察到了MEF2C高表达组具有更低的EFS和OS率，但由于样本量不足，多数因素差异无统计学意义，仅正常核型AML患者MEF2C高表达组3年EFS率明显低于低表达组。今后需进一步扩大样本量来进一步验证MEF2C基因高表达是否提示AML预后不良。
综上所述，本研究是首次分析MEF2C mRNA表达水平在成人AML患者中的表达情况及其临床意义，结果显示成人AML（M3除外）患者MEF2C基因中位表达水平达18.22×10-3。小样本的病例结果分析提示AML患者中MEF2C mRNA高表达组3年EFS率及OS率均低于低表达组，提示MEF2C可能是预后不良的分子标志，值得继续扩大样本来进一步研究。同时整合目前在AML中的一些突变基因如NPM1、FLT3[19,20]以及WT1[21]、SET[22]等表达水平等对预后的影响，以及细胞遗传学、患者年龄、治疗方案等多个因素进行多因素分析明确MEF2C表达水平是否为一个独立的预后因素，并且验证监测MEF2C基因mRNA水平作为一项新的残留病灶标志的可行性，进一步探索MEF2C基因在AML的靶向治疗中的可能性。
