通过对新型冠状病毒相关研究的综述，加深对新型冠状病毒的理解，为靶向药物开发和疫苗设计提供新思路，防控新型冠状病毒肺炎。
通过文献调研、数据分析等方法，探究表观转录组学修饰调控新型冠状病毒复制和感染力的过程与机制。
为新型冠状病毒感染及新发突发传染病防控提供重要的思路和技术支撑。
以表观转录组学的研究新方向作为切入点，有望开启新的科研理念与范式。
版权归中华医学会所有。
未经授权，不得转载、摘编本刊文章，不得使用本刊的版式设计。
除非特别声明，本刊刊出的所有文章不代表中华医学会和本刊编委会的观点。
冠状病毒是一类能够引起动物和人类呼吸道和胃肠道感染的病毒。2002年底，我国暴发SARS-CoV感染导致严重急性呼吸综合症，俗称传染性非典型肺炎。2012年，MERS-CoV感染导致中东呼吸系统综合症。这两种冠状病毒是在人类中出现的高传播性和致病性的病毒。2019年末，在我国湖北武汉传播的新型冠状病毒肺炎则是由一种新型冠状病毒(SARS-CoV-2)感染引起的。虽然新型冠状病毒致病力不如非典SARS等冠状病毒，但是该病毒传播力极强，目前感染人数已经远远超过了SARS。2020年1月31日，世界卫生组织宣布新型冠状病毒肺炎疫情构成国际关注的突发公共卫生安全事件。国家卫健委近期发布通知，将"新型冠状病毒感染的肺炎"暂命名为"新型冠状病毒肺炎"，简称"新冠肺炎"。新冠肺炎疫情的发生严重威胁公共健康，及时控制疫情并增强新发突发传染病的防控能力，已迫在眉睫。
过去的研究表明，SARS等其它冠状病毒基因组RNA的5’端具有帽子结构(m7GpppNm)等转录后修饰，该修饰对于病毒基因组的复制、病毒的感染能力以及逃避宿主先天免疫系统的识别非常重要。转录后修饰作为目前生命科学的前沿领域之一，为新型冠状病毒的研究提供了新视角和新方向。本文从RNA表观转录组学修饰的研究角度作为切入点，综述了转录后修饰调控SARS等冠状病毒复制和感染的过程与机制，为针对新型冠状病毒靶向药物的开发和新型减毒活疫苗的设计提供理论依据。
冠状病毒是巢式病毒目(Nidovirales)冠状病毒科(Coronaviridae)的一类具有包膜(Envelope)的单股正链RNA病毒。冠状病毒粒子呈粗糙的球形，具有多形性，直径50~200nm。冠状病毒广泛分布于人类、其他哺乳动物和鸟类之中，可引起急性和持续性感染。早在20世纪30年代，病毒学家就从鸡传染性支气管炎、猪传染性胃肠炎、小鼠重型肝炎等疾病中分离出冠状病毒。然而直到20世纪60年代，人们才认识到这些病毒与一些人类呼吸道病毒具有共同的特征，并将它们归类在一起。这类病毒最普遍的形态学特征就是在电子显微镜下可以观测到病毒包膜上有向外的凸起，呈现出日冕的外观，冠状病毒因此得名[1]。
根据冠状病毒的系统发育关系和基因组结构，冠状病毒可分为4个属，α(Alphacoronavirus)属、β(Betacoronavirus)属、γ(Gammacoronavirus)属以及δ(Deltacoronavirus)属。α和β冠状病毒属的病毒只感染哺乳动物，可引起人类呼吸系统疾病、动物的胃肠道疾病，而γ和δ冠状病毒属的大部分病毒感染鸟类，部分也可以感染哺乳动物[2]。严重急性呼吸综合征病毒(SARS-CoV)、中东呼吸综合征病毒(MERS-CoV)和新型冠状病毒(SARS-CoV-2)都属于β冠状病毒属，能引起人严重的呼吸系统疾病甚至死亡。
冠状病毒基因组大小为26~32 kb，是已知RNA病毒中最长的[1]。与真核生物mRNA非常相似，冠状病毒具有5’端的甲基化"帽子"(Cap)和3’端的多聚腺苷酸"尾巴"(PolyA)结构，冠状病毒基因组两端分别存在一个非翻译区，并且在5’非翻译区前还有一个先导序列，在病毒转录和翻译过程中发挥重要作用。冠状病毒5’端编码区包含两个大的开放阅读框ORF1a和ORF1b，约占基因组全长的三分之二，负责编码pp1a和pp1ab两个多聚蛋白。这些多聚蛋白随后被进一步酶解形成16种参与基因组转录和复制的非结构蛋白(nsp1-nsp16，γ冠状病毒中无nsp1)。冠状病毒3’端基因组负责编码4种结构蛋白，包括刺突蛋白(Spike，S)、包膜蛋白(Envelope，E)、膜蛋白(Membrane，M)和核衣壳蛋白(Nucleocapsid，N)。所有的冠状病毒的基因组组成都非常相似，都以5’-复制酶-S-E-M-N-3’的基因次序排列[1,2]。此外，在结构蛋白之间还存在一些小的开放阅读框，它们编码一些种属特异的蛋白，尽管不是病毒复制所必需的蛋白，但它们与病毒的致病性和群特异性密切相关[3]。
冠状病毒通过刺突蛋白与宿主细胞受体结合之后，刺突蛋白构象发生改变介导病毒与宿主细胞融合，病毒以内吞方式进入宿主细胞，并将其基因组释放到宿主细胞质内。病毒的帽子结构通过招募宿主细胞中的eIF4E等蛋白组装成起始翻译复合物，翻译产生多聚蛋白pp1a和pp1ab。随后pp1a和pp1ab被酶解成16种非结构蛋白，在核衣壳蛋白的参与下，与一些宿主因子和病毒基因组RNA(Genomic RNA, gRNA)组装形成复制转录复合体(Replicase-transcriptase complex, RTC)，以复制和转录两种方式合成负链RNA。在复制过程中，以基因组RNA为模板合成全长的负链RNA，并再以该全长的负链RNA为模板合成全长正链基因组RNA。在转录过程中，以"负链不连续转录"的机制合成长度不一的负链亚基因组RNA [Subgenomic (-) RNA]。这些长度不一的负链亚基因组RNA随后被转录成正链亚基因组mRNA [Subgenomic (+) mRNA]。虽然这些正链亚基因组mRNA可能包含多个开放阅读框，但只有靠近5’端的第一个开放阅读框被翻译成蛋白。翻译产生的结构蛋白和复制产生的病毒基因组RNA包装产生新的病毒颗粒，释放到细胞外，从而开始感染其他细胞[1]。
新型冠状病毒是β冠状病毒属新型病毒，有包膜，病毒颗粒直径60~140 nm，呈圆形或椭圆形，常为多形性。病毒对紫外和热敏感，56 ℃ 30分钟可灭活病毒。乙醚、75%乙醇、含氯消毒剂、过氧乙酸和氯仿等脂溶剂亦可有效灭活病毒，而氯已定不能有效灭活病毒。该病毒基因组全长29 903个核苷酸，其中前265个核苷酸为5’非翻译区，最后229个核苷酸为3’非翻译区，预测的ORF1ab长度为21 291个核苷酸，在ORF1ab下游至少存在13个开放阅读框[4]。基因组比对分析发现，新型冠状病毒基因组分别与蝙蝠病毒SARS-like CoV和中菊头蝠病毒RaTG13序列相似性达89.1%和96.2%[4,5]。对新型冠状病毒保守的结构蛋白序列比对发现，新型冠状病毒属于SARSr-CoV种[5]。血管紧张素转化酶II(Angiotensin converting enzyme II, ACE2)是SARS-CoV的细胞受体，研究指出新型冠状病毒与SARS-CoV受体结合域(Receptor-binding domain, RBD)高度相似[4]，病毒感染性实验也表明ACE2可能也是新型冠状病毒的细胞受体[5]。目前研究认为蝙蝠可能是新型冠状病毒的天然宿主[4]，但其中间宿主、病毒复制、感染力及其作用机制还需要进一步深入研究。
新型冠状病毒感染会引起人的新型冠状病毒肺炎(COVID-19)，感染者会出现发热、咳嗽、乏力、逐渐呼吸困难等症状；在较严重病例中，还会出现急性呼吸窘迫综合征、脓毒症休克、难以纠正的代谢酸中毒等，甚至死亡。目前暴发的新冠肺炎，截至2020年2月11日24时，中国已确诊44 653例，死亡1 113例[6]。对早期确诊的425名武汉病例调查发现，患者平均年龄59周岁，56%为男性。在2020年1月1号之前出现的病例，55%的发病患者都有武汉市华南海鲜批发市场接触史，而随后的病例中只有8.6%与该市场有关。新冠肺炎平均潜伏期为5.2天。到2020年1月4日为止，流行病增长率为0.10/天，平均每7.4天病例增多一倍，人传人的平均间隔为7.5天，估计基本传染数为2.2[7]。据国家卫健委推算，截至2020年2月3日24时，我国新冠肺炎确诊病例的病死率为2.1%。目前认为新冠肺炎的主要传染源是新冠肺炎患者，主要传播途径是飞沫传播，也可经接触传播。人群普遍易感，老人及有基础疾病患者病情较严重，婴幼儿及儿童也有感染。
之前的研究表明，RNA甲基化修饰对于病毒感染至关重要。早在1974年，Miura等人就在一种双链RNA病毒——胞质型多角体病毒中发现了5’端加帽修饰[8,9]，随后的一系列研究表明，病毒基因组RNA存在多种修饰，包括N7-甲基鸟嘌呤(m7G)、2’-O-甲基(Nm)、N6-甲基腺嘌呤(m6A)等(图1)，这些修饰在病毒侵染宿主过程中起到了重要的作用。
与真核生物mRNA类似，大部分病毒基因组RNA 5’端具有帽子结构，即N-7-甲基鸟嘌呤核苷(m7G)通过5’-5’三磷酸键与第一个转录的核苷酸相连，并且转录的第一个和第二个核苷酸的糖环2’-OH还可以进一步被甲基化修饰，最终可以形成Cap 0型(m7GpppN)、Cap 1型(m7GpppNm)和Cap 2型(m7GpppNmpNm)帽子结构[10]。病毒的Cap修饰可以防止宿主识别外源RNA，增强病毒RNA在宿主细胞内的稳定性。早期的研究表明，冠状病毒家族成员小鼠肝炎病毒(MHV)的mRNA具有Cap 1型帽状结构[11,12]。2003年SARS暴发后，对冠状病毒的加帽修饰以及复制机制研究逐渐成为热点。由于冠状病毒是在细胞质内复制，而宿主mRNA是在细胞核内加Cap修饰，所以冠状病毒需要使用自身基因组编码甲基化酶来进行Cap修饰，利用宿主的核糖体进行翻译。冠状病毒基因组编码的nsp13具有5’三磷酸酶活性，nsp14具有m7G甲基转移酶活性，nsp16具有2’-O-甲基转移酶活性。
2009年，有研究者利用酵母功能性互补筛选系统，对SARS冠状病毒的非结构蛋白进行研究，发现m7G甲基转移酶位于nsp14蛋白C端区域，进一步利用复制子系统对m7G甲基化活性的关键残基进行突变分析发现，突变体D331A的复制和转录能力与野生型相比显著下降。进一步对另一种在进化上与SARS病毒相距较远的α属冠状病毒——传染性胃肠炎冠状病毒(TGEV)进行研究，发现其非结构蛋白nsp14同样具有m7G甲基酶活性，说明nsp14的N7-MTase功能在冠状病毒中可能是保守的，这也许为新型冠状病毒也存在加帽修饰提供了间接证据[13]。另一方面，m7G甲基转移酶在冠状病毒复制和致病机制中扮演重要作用，利用反向遗传学技术对小鼠肝炎冠状病毒MHV-A59 nsp14的甲基转移酶区域引入Y414H突变后，发现该突变病毒在体外细胞培养时复制能力不受影响，但是Y414H突变明显减弱了病毒在小鼠体内的复制和毒力，C57BL/6小鼠的颅内接种结果显示突变后的病毒已不再具有致病性[14]。
冠状病毒加帽结构的2’-O-甲基修饰由nsp16负责催化，活性检测结果显示猫冠状病毒(FcoV)nsp16对5’端m7G甲基化的帽子结构具有2’-O-甲基修饰活性[15]，后续对SARS病毒的体外实验发现，nsp16蛋白单独在体外没有活性，当nsp10作为辅助因子帮助nsp16与m7GpppA-RNA底物结合时，nsp16表现出较强的修饰活性[16,17]。研究人员对人和小鼠冠状病毒的2’-O-甲基转移酶关键活性位点进行突变研究发现，这些突变体病毒可以被宿主胞浆内的固有免疫受体MDA5识别并诱导宿主体内I型干扰素的高表达，最终导致MHV突变毒株不能在小鼠体内进行正常复制[18]。此外，2’-O-甲基修饰还可以帮助冠状病毒逃逸干扰素诱导蛋白IFIT1和IFIT2识别产生的抗病毒效应，研究表明，冠状病毒2’-O-甲基转移酶D130A突变体在小鼠细胞中的复制能力显著减弱。由此可见，冠状病毒的2’-O-甲基修饰在逃避先天性宿主抗病毒反应方面发挥重要作用。
迄今为止，虽然研究人员还未在冠状病毒家族的基因组RNA中发现加帽之外的其他修饰，但在与冠状病毒类似的其他单股正链RNA病毒中，例如寨卡病毒(ZIKV)、丙型肝炎病毒(HCV)、手足口病肠道病毒71型(EV71)等，发现基因组RNA上还存在N6-甲基腺嘌呤核苷(m6A)修饰，并且m6A对病毒的复制及感染能力起到了关键调控作用[19]。m6A是真核生物mRNA上最普遍的内部修饰之一，由METTL3/14异源二聚体的甲基化酶复合物催化产生，并且甲基化位点具有较为保守的RRACU(R＝A或G)基序。m6A能够调节mRNA的结构、稳定性、加工过程和翻译过程，并且这种动态调控的修饰具有组织特异性[20,21]。
高分辨率质谱定量和m6A高通量测序实验均显示寨卡病毒RNA上含有丰富m6A修饰，此外，ZIKV感染过程还会改变宿主mRNA上m6A分布位置和修饰比例。敲低宿主m6A甲基转移酶复合物时病毒复制能力增加，相反，敲低去甲基化酶FTO，病毒复制能力减弱。进一步研究发现m6A结合蛋白YTHDF2与ZIKV RNA结合并促进转录本降解[22]。对黄病毒科的另一种病毒HCV的研究表明，敲低宿主m6A甲基转移酶METLL3不影响病毒RNA复制过程，而是促进感染性HCV病毒粒子的产生及释放，因此m6A修饰抑制HCV的感染能力[23]。EV71病毒在感染宿主后会影响宿主m6A甲基转移酶、去甲基化酶及其结合蛋白表达和定位。研究者发现，EV71感染Vero细胞后的24 h和48 h，宿主体内的METTL3和METTL14蛋白表达量显著上升，去甲基化酶FTO的表达量显著降低。原本定位在细胞核散斑的m6A修饰酶以及结合蛋白YTHDC1在EV71感染后，也开始出现在细胞质中。从而对细胞质中的病毒RNA进行m6A甲基化。除此之外，研究者发现宿主m6A甲基转移酶METTL3可与病毒RNA依赖性RNA聚合酶RdRp 3D相互作用，并诱导聚合酶3D蛋白的SUMO化和泛素化，从而增加RNA聚合酶RdRp 3D蛋白的稳定性，进而促进EV71病毒的复制能力。突变病毒基因组的两个m6A修饰位点后病毒复制减少，证实了m6A修饰对于EV71的复制具有促进作用[24]。由此可见，作为一种RNA表观遗传修饰，m6A在病毒的复制和感染过程以及病毒与宿主的相互作用过程中具有不同的调控功能。
疫苗和药物是控制传染性疾病的最有效方式。针对目前横行的新冠肺炎，各科研机构都在紧急研发相关药物。目前，针对新冠肺炎的几类药物主要靶向冠状病毒基因组编码的非结构蛋白(3C样蛋白酶和木瓜蛋白酶样蛋白酶、解旋酶、聚合酶RdRp)、结构蛋白(例如刺突糖蛋白)和辅助蛋白。包含以下3类：(1)靶向病毒复制关键酶RdRp的广谱核苷类抑制剂。主要包括已上市的抗病毒药(法匹拉韦和利巴韦林)，以及实验用药瑞德西韦(Remdesivir)。这些药物可以竞争性抑制RdRp的底物，从而阻断病毒RNA合成。瑞德西韦由美国Gilead公司研发，曾用于冠状病毒SARS和MERS的治疗研究，前期体外和动物实验结果显示具有一定的抗病毒效应[25]。国外已经开展瑞德西韦用于治疗埃博拉病毒的临床试验，最近，我国研究者发现瑞德西韦在体外细胞水平上对新冠肺炎也有较好的抑制作用[26]，目前，国内针对瑞德西韦治疗新冠肺炎的临床试验已经启动。(2)靶向病毒蛋白酶的抑制剂。包括已批准的蛋白酶抑制剂二硫仑，以及曾用于艾滋病治疗的蛋白酶抑制剂药物洛匹那韦(Lopinavir)/利托那韦(Ritonavir)，这些药物在体外对SARS和MERS具有一定活性。(3)靶向病毒刺突糖蛋白的抑制剂。刺突糖蛋白是病毒与宿主ACE2受体结合的关键蛋白，格瑞弗森(Griffithsin)是一种源自于红藻的凝集素，可与多种病毒糖蛋白表面的寡糖结合，从而能抑制病毒。除此之外，还有靶向宿主的一类药物，用于增强宿主的先天性抗病毒反应。目前，聚乙二醇化干扰素组合利巴韦林的临床试验已经开始(ChiCTR2000029387)。但是，现在还缺乏这些药物对此次新冠肺炎的临床治疗证据，针对新冠肺炎研发更特异和高效的抗病毒新药仍然至关重要。过去的研究表明，冠状病毒加帽酶对于基因组复制是必须的，它的蛋白序列、结构和催化机制与哺乳动物之间存在差别。曾有研究人员利用酵母系统构建了抗冠状病毒药物筛选平台，鉴定了3个微生物提取物可以有效抑制病毒m7G甲基转移酶活性，同时该提取物对宿主m7G甲基转移酶的活性抑制作用非常微弱[27]，因此，以新型冠状病毒的m7G甲基转移酶和2’-O-甲基转移酶作为靶标也许可以为新冠肺炎的药物研发提供一个新方向。
另一方面，研发出有效的疫苗也是阻止新型冠状病毒的快速传播的有效途径。过去对登革热病毒和SARS病毒疫苗研究发现，利用反向遗传学技术对2’-O甲基修饰酶活性位点进行突变可产生重组的减毒疫苗[28,29]。绘制新型冠状病毒的RNA帽子相关修饰(m7G、Nm)以及内部修饰(m6A等)修饰图谱并解析RNA修饰的调控机制，或许可以为新型冠状病毒的减毒活疫苗设计提供一些重要的理论基础。
志谢 感谢北京大学生命科学学院宋靖慧博士对本文写作给予的帮助
所有作者均声明不存在利益冲突
