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黄芪对小鼠胰岛炎及胰岛β细胞凋亡的保护作用
中华实用儿科临床杂志, 2013,28(8) : 577-580. DOI: 10.3760/cma.j.issn.2095-428X.2013.08.006
摘要
目的

探讨黄芪在体内对胰岛β细胞的保护作用。

方法

将56只健康雄性昆明小鼠随机分为对照组、糖尿病(DM)对照组及不同剂量黄芪干预组。不同剂量黄芪预处理小鼠，链脲佐菌素(STZ)腹腔注射诱导DM发生，观察DM发生情况；硝酸还原酶法检测各组小鼠血清中一氧化氮(NO)水平；化学比色法检测血清中诱导型一氧化氮合酶(iNOS)活性；ELISA法检测血清胰岛素水平；病理切片观察胰岛炎积分；末端脱氧核苷酰基转移酶介导dUTP切口末端标记法检测胰岛β细胞凋亡。

结果

1.DM对照组小鼠于STZ注射1周后开始发病。黄芪大剂量[30 g/(kg·d)]组于STZ注射2周后开始发病，与DM对照组比较，DM发生延缓，DM发病率显著降低(P<0.01)。黄芪小剂量[15 g/(kg·d)]组于STZ注射1周后开始发病，与DM对照组比较，DM发病率有所降低，但差异无统计学意义(P>0.05)。2.与DM对照组比较，黄芪大剂量组显著降低iNOS活性和NO水平(P均<0.01)，同时降低胰岛炎积分和胰岛β细胞凋亡率(P均<0.01)。黄芪小剂量组上述指标均有所降低，但差异无统计学意义(P均>0.05)。

结论

在体内黄芪对胰岛β细胞具有保护作用，与降低iNOS活性、减少NO生成，抑制胰岛β细胞凋亡有关；并可改善机体清除自由基能力，有效预防和延缓DM的发生。

引用本文: 郝萌萌, 李蕾, 陈志红, 等.  黄芪对小鼠胰岛炎及胰岛β细胞凋亡的保护作用 [J] . 中华实用儿科临床杂志, 2013, 28(8) : 577-580. DOI: 10.3760/cma.j.issn.2095-428X.2013.08.006.
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1型糖尿病(T1DM)是由T淋巴细胞介导的自身免疫性疾病，以胰岛β细胞选择性破坏为特征。T1DM发生时出现Th1/Th2失衡，Th1型细胞因子分泌增多，进而活化巨噬细胞，产生TNF-α、IL-1β等细胞因子及氧自由基、一氧化氮(NO)等，导致胰岛β细胞损伤，最终导致T1DM的发生[1]。研究表明，自由基在T1DM胰岛β细胞的损伤中发挥重要作用[2]，一方面通过直接损伤胰岛β细胞，也可诱导胰岛β细胞凋亡，也可以通过影响胰岛素的合成及分泌而降低胰岛β细胞的功能[3,4]。因此推断，改善机体自由基清除能力可以保护胰岛β细胞，防治T1DM的发生。黄芪是一种良好的高效自由基清除剂[5]，本课题组前期研究已经证明黄芪在体外对胰岛β细胞具有保护作用[6]，本研究设想应用黄芪改善机体自由基清除能力，观察能否在体内有效保护胰岛β细胞。

1　材料与方法
1.1　实验动物

4～5周龄(相当于人类学龄期儿童，即6～12岁)健康雄性昆明小鼠(SPF级)56只，体质量18～22 g，购自青岛市药检所，合格证号：SCXK(鲁)20090007，饲养于青岛大学医学院附属医院动物实验中心(SPF级)。

1.2　药物与试剂

黄芪注射液购自河北省石家庄神威药业有限公司，生产批号：Z13020999，每10 mL含有生药黄芪20 g；链脲佐菌素(STZ)购自美国Sigma公司；NO试剂盒、诱导型一氧化氮合酶(iNOS )法试剂盒购自南京建成生物研究所；胰岛素ELISA检测试剂盒购自美国R&D公司；末端脱氧核苷酰基转移酶介导dUTP切口末端标记(TUNEL)法试剂盒购自美国Promega公司。One Touch Ⅱ血糖仪和试纸购自美国强生公司。

1.3　方法
1.3.1　分组及模型制备

将56只小鼠分为4组，即对照组、糖尿病(DM)对照组、小剂量黄芪＋STZ组(黄芪小剂量组)和大剂量黄芪＋STZ组(黄芪大剂量组)。所有小鼠适应性饲养1周后，黄芪小剂量组和黄芪大剂量组分别以黄芪生药15、30 g/(kg·d)连续腹腔注射10 d，对照组和DM对照组腹腔注射同体积的9 g/L盐水。之后DM对照组、黄芪小剂量组和黄芪大剂量组小鼠均给予STZ 40 mg/(kg·d)续腹腔注射5 d，诱导T1DM模型，对照组腹腔注射同体积柠檬酸盐缓冲液。观察3周后，摘取眼球取血1 mL，留取血清，置－20 ℃冰箱保存备用。脱颈处死小鼠，打开腹腔，分别分开胃窦与十二指肠之间及胃与脾之间的薄膜，暴露胰腺，分离胰腺组织，40 g/L甲醛固定，常规制作石蜡切片，留作HE染色及细胞凋亡检测。

1.3.2　血糖、体质量及DM发生情况观察

STZ注射后，观察3周，每周于同一时间段测小鼠体质量，尾静脉取血，快速血糖仪测血糖，血糖连续2次≥16.7 mmol/L即诊断为DM[7,8]。

1.3.3　血清NO水平、iNOS活力及胰岛素检测

应用RS232C型紫外分光光度计，NO试剂盒硝酸还原酶法测血清中NO水平；iNOS测定试剂盒化学比色法测血清中iNOS活力；应用DENLEYDRAGON Wellscan MK 3型酶标仪，胰岛素ELISA检测试剂盒检测血清胰岛素水平。所有操作严格按照试剂盒说明进行。

1.3.4　黄芪对小鼠胰岛炎影响的观察

STZ注射后，观察3周，脱颈处死小鼠，留取胰腺组织，制备石蜡切片，HE染色，光镜下观察胰岛炎，由2位实验者盲法阅片，每只小鼠胰腺病理切片观察5个胰岛。胰岛炎采用国内外常用的方法进行分级[9]：0分：胰岛周围及胰岛内无淋巴细胞浸润；1分：胰岛周围有淋巴细胞浸润但未侵入胰岛；2分：胰岛内有淋巴细胞浸润，受累面积<25%；3分：胰岛内有淋巴细胞浸润，受累面积在25%～75%；4分：胰岛内有淋巴细胞浸润，受累面积>75%。

1.3.5　黄芪对胰岛β细胞凋亡影响的观察

采用TUNEL法检测，操作按照试剂盒说明进行。将胰腺组织切片置于光学显微镜下观察，胰岛细胞核呈棕褐色为阳性凋亡细胞。每张切片选取3个阳性细胞数较多的高倍视野，计算平均每100个胰岛细胞中阳性细胞所占的百分比，即胰岛细胞凋亡率。

1.4　统计学处理

应用SPSS 17.0软件进行统计。数据采用±s表示，样本均数采用单因素方差分析。样本率的比较采用Fisher's确切概率法。胰岛炎积分采用Ridit分析。百分率资料进行非参数秩和检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2　结果
2.1　黄芪对各组小鼠DM发病率的影响

应用STZ后，DM对照组及黄芪小剂量组于STZ注射1周后开始出现DM，而黄芪大剂量组于2周后开始出现DM；3周时，与DM对照组DM发病率(92.85%)比较，黄芪大剂量组(21.43%)明显降低，黄芪小剂量组发病率(71.43%)较DM对照组低，但差异无统计学意义(P>0.05)。黄芪大剂量组DM发病率显著低于黄芪小剂量组(P<0.05)。见图1。

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图1
对照组、DM对照组及黄芪大剂量组、黄芪小剂量组小鼠DM发病率的比较
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图1
对照组、DM对照组及黄芪大剂量组、黄芪小剂量组小鼠DM发病率的比较
2.2　各组小鼠血糖、体质量变化

STZ注射3周后，与对照组比较，各组小鼠血糖水平均明显增高(P均<0.05)；黄芪大剂量组小鼠血糖水平明显低于DM对照组(P<0.01)，黄芪小剂量组小鼠血糖水平也低于DM对照组，但差异无统计学意义(P>0.05)；黄芪大剂量组小鼠血糖明显低于黄芪小剂量组(P<0.01)，见表1。STZ注射后，对照组及黄芪大剂量组小鼠体质量稳步增长，其余2组体质量增长缓慢；至STZ注射3周后，与对照组比较，黄芪大剂量组小鼠体质量无显著差异(P>0.05)，其余2组体质量显著降低(P均<0.01)；与DM对照组比较，黄芪大剂量组小鼠体质量显著增高(P<0.01)，黄芪小剂量组小鼠体质量虽然也增高，但差异无统计学意义(P>0.05)；黄芪大剂量组小鼠体质量显著高于黄芪小剂量组(P<0.05)。见表2。

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表1

对照组、DM对照组及黄芪大剂量组、黄芪小剂量组小鼠血糖变化(mmol/L，±s)

表1

对照组、DM对照组及黄芪大剂量组、黄芪小剂量组小鼠血糖变化(mmol/L，±s)

组别例数注射STZ前血糖注射STZ后血糖
1周2周3周
对照组147.90±1.108.01±0.967.71±1.477.80±0.73
DM对照组147.84±1.2017.12±7.10a25.86±7.70a27.73±6.66a
黄芪小剂量组147.53±1.1611.81±5.00bc17.19±8.23ac23.58±8.63a
黄芪大剂量组147.88±1.209.21±1.73c12.54±6.24c13.66±8.21bcd
F值 0.31711.56519.88524.795
P值 0.8130.0000.0000.000

注：与对照组比较，aP<0.01，bP<0.05；与DM对照组比较，cP<0.01；与黄芪小剂量组比较，dP<0.01

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表2

对照组、DM对照组及黄芪大剂量组、黄芪小剂量组小鼠体质量变化(g，±s)

表2

对照组、DM对照组及黄芪大剂量组、黄芪小剂量组小鼠体质量变化(g，±s)

组别例数注射STZ前体质量注射STZ后体质量
1周2周3周
对照组1435.41±2.9640.96±2.7443.85±3.3044.91±3.34
DM对照组1434.22±2.2737.69±3.36a40.13±3.57a40.43±3.76a
黄芪小剂量组1434.56±2.3338.35±2.82b40.40±3.25a41.16±3.49a
黄芪大剂量组1435.09±2.3540.11±3.09c42.92±3.00ce43.98±3.08de
F值 0.6403.5514.4135.572
P值 0.5930.0210.0080.002

注：与对照组比较，aP<0.01，bP<0.05；与DM对照组比较，cP<0.05，dP<0.01；与黄芪小剂量组比较，eP<0.05

2.3　各组小鼠血清iNOS活力、NO和胰岛素水平比较

与对照组比较，各实验组小鼠血清NO水平及iNOS活力明显增高(P均<0.05)，胰岛素水平明显降低(P均<0.05)；与DM对照组比较，黄芪大剂量组小鼠血清NO水平及iNOS活力均明显降低(P均<0.01)，胰岛素水平明显增高(P<0.01)；黄芪小剂量组小鼠血清NO水平及iNOS活力有所降低，胰岛素有所增高，但差异无统计学意义(P均>0.05)；黄芪大剂量组小鼠血清NO水平及iNOS活力明显低于黄芪小剂量组(P<0.01)，胰岛素水平显著高于黄芪小剂量组(P<0.01)。见表3。

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表3

对照组、DM对照组及黄芪大剂量组、黄芪小剂量组小鼠血清iNOS、NO及胰岛素水平比较(±s)

表3

对照组、DM对照组及黄芪大剂量组、黄芪小剂量组小鼠血清iNOS、NO及胰岛素水平比较(±s)

组别例数iNOS(KU/L)NO(μmol/L)胰岛素(pmol/L)
对照组145.56±1.6943.36±18.25526.56±72.70
DM对照组1410.28±2.13a83.82±20.77a272.57±77.60a
黄芪小剂量组149.44±2.29a79.27±20.44a325.46±119.11a
黄芪大剂量组147.16±2.01bcd58.58±18.38bcd432.59±98.68bcd
F值 15.57213.02820.355
P值 0.0000.0000.000

注：与对照组比较，aP<0.01，bP<0.05；与DM对照组比较，cP<0.01；与黄芪小剂量组比较，dP<0.01

2.4　黄芪对各组小鼠胰腺炎症程度的影响

胰腺病理学观察结果显示，黄芪预干预可以减轻胰岛炎程度。黄芪大剂量组胰岛炎积分以0、1分为主，黄芪小剂量组以1、2分为主，镜下胰岛数目较多，形态规则。DM对照组以2、3分为主，胰岛及胰岛周围炎症浸润明显，胰岛数量少，形态不规则。分级结果见表4。

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表4

对照组、DM对照组及黄芪大剂量组、黄芪小剂量组各等级胰腺炎症程度的胰岛个数

表4

对照组、DM对照组及黄芪大剂量组、黄芪小剂量组各等级胰腺炎症程度的胰岛个数

组别例数0分1分2分3分4分
对照组14700000
DM对照组1401530196
黄芪小剂量组1441828164
黄芪大剂量组1432231230

注：H＝146.991，P＝0.000

2.5　黄芪对胰岛β细胞凋亡的影响

TUNEL染色检测凋亡细胞，显微镜下观察可见：正常胰岛细胞胞核呈蓝色，核大小正常，凋亡胰岛细胞核呈棕褐色(图2)，核固缩。与对照组[(5.00±1.83)%]比较，各实验组组胰岛β细胞凋亡率明显增高(P均<0.01)；与DM对照组[(32.36±7.23)%]比较，黄芪大剂量组β细胞凋亡率[(13.93±5.20)%]显著降低(P<0.01)，黄芪小剂量组β细胞凋亡率[(28.21±6.72)%]虽然也有降低，但差异无统计学意义(P>0.05)；黄芪大剂量组胰岛β细胞凋亡率显著低于黄芪小剂量组(P<0.01)。

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图2
对照组、DM对照组及黄芪小剂量组、黄芪大剂量组小鼠胰岛β细胞凋亡情况(TUNEL染色，×400)
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注：A：对照组；B：DM对照组；C：黄芪小剂量组；D：黄芪大剂量组

图2
对照组、DM对照组及黄芪小剂量组、黄芪大剂量组小鼠胰岛β细胞凋亡情况(TUNEL染色，×400)
3　讨论

研究发现，T1DM早期患者机体免疫功能失调，抗氧化能力下降，而胰岛是对氧化应激敏感的组织，抗氧化酶表达的降低，使其更容易受到自由基的攻击[10]，因此，自由基在DM发生、发展过程中起重要作用。

在体内，L-精氨酸在NOS的作用下与氧气反应产生NO。过量的NO作为一种高效自由基，一方面与含铁硫中心的酶反应，使之失活，损伤线粒体及DNA，在胰腺组织局部损伤胰岛β细胞功能；另一方面与超氧化物阴离子自由基反应生成毒性更强的自由基，诱导胰岛β细胞凋亡[11,12]。黄芪具有抗氧化、清除自由基的功能。研究报道，黄芪对DM大鼠胰岛β细胞具有保护作用。本研究参考这些研究[13,14,15]，选择了15 g/kg作为小剂量，结合前期体外研究结果，与含有100 g/L黄芪培养液相比，200 g/L黄芪培养液预处理的胰岛β细胞显现出更好的自由基清除能力和胰岛β细胞保护作用[6]，因此，本研究大胆选用黄芪30 g/kg作为大剂量，观察大剂量是否与小剂量在体内对胰岛β细胞具有相同或更好保护作用。结果显示30 g/kg黄芪对胰岛β细胞具有显著保护作用，而15 g/kg黄芪没有明显保护作用。

前期细胞水平研究已经证实，黄芪干预可以显著降低自由基NO的产生[6]。本研究也检测小鼠血清NO水平，同时检测iNOS活性，结果显示大剂量黄芪干预组iNOS活性较DM对照组显著降低，同时NO生成量也明显减少(P<0.01)，胰岛炎程度减轻；与DM对照组比较，DM发病延缓，于STZ诱导2周时开始出现DM，并且DM发病率明显降低，即使发病的DM小鼠，血糖水平也较DM对照组明显降低。本研究再次证明NO与T1DM密切相关。同时提示，改善机体自由基清除能力可以延缓和预防DM的发生。黄芪通过预免疫改善机体自由基清除能力，提高机体的抗自由基功能，抑制体内iNOS活性，减少NO本身及其介导的自由基的产生；另外黄芪可能参与预防免疫，调节细胞因子失衡，纠正抑制性T淋巴细胞缺陷，恢复其功能，间接阻止细胞因子刺激引起iNOS活力增强导致的NO增多，阻断NO介导的自由基产生过程，进一步减少对胰岛β细胞损伤，保护胰岛β细胞结构完整性及功能，防治DM的发生[16,17]。

在T1DM发生和发展过程中，凋亡是胰岛β细胞死亡的主要方式[18,19]。前期细胞水平研究发现，NO可以诱导胰岛β细胞凋亡，降低β细胞存活率，而黄芪干预可以明显降低胰岛β细胞凋亡，显著提高β细胞存活率[6]。本研究检测胰岛β细胞凋亡，结果显示，STZ诱导的T1DM小鼠胰岛β细胞凋亡率增加。黄芪预干预后，血清中NO明显降低的同时，小鼠胰岛β细胞凋亡率明显下降，进一步证实NO参与胰岛β细胞凋亡过程，自由基与胰岛β细胞凋亡密切相关。黄芪通过提高机体自由基清除能力，可以显著降低胰岛β细胞凋亡，保护胰岛β细胞功能。

综上，黄芪在体内同样具有保护胰岛β细胞的作用。在国内，本研究首次发现应用黄芪预免疫可改善机体自由基清除能力，降低iNOS活性，阻断NO及其介导的自由基产生，减少胰岛β细胞凋亡，有效保护胰岛β细胞结构完整性及功能，进而延缓和防治T1DM的发生。同时应用30 g/kg剂量的黄芪，获得上述研究结果，实验中未发现此大剂量黄芪对胰岛β细胞的损害，再次证明黄芪的安全性。作为中国的传统中医药，黄芪因其天然性，制备方便等优点，有望成为T1DM的干预药物，临床更加关注的黄芪对DM的治疗作用正在进一步研究中。

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