作者前期实验经"高通量测序"得到T淋巴细胞白血病细胞株基因表达数据，经生物信息学分析得一新序列，暂命名为J441。为了对这一新序列进行进一步深入研究，本实验构建了T淋巴细胞白血病新基因J441与FLAG标签肽融合基因慢病毒载体。
引物上引入FLAG标签，实时荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)从T淋巴细胞白血病细胞系Jurkat细胞中钓取J441的开放阅读框(ORF)片段，形成J441-FLAG融合基因，并将之克隆到带GFP荧光报告基因的慢病毒表达载体质粒pHAGE-CMV-MCS-IzsGreen中构建成pHAGE-J441-FLAG质粒，利用脂质体将其与包装质粒psPAX2和包膜质粒pMD2.G共转染293T细胞。收集含有病毒的上清，浓缩，鉴定。取浓缩纯化后的病毒上清感染293T细胞和宿主Jurkat细胞。观察荧光及测序鉴定293T细胞中J441的表达，细胞免疫荧光检测293T细胞中FLAG的表达及细胞定位，预测J441的细胞定位。
核酸序列测序证实成功构建了含J441-FLAG基因的重组慢病毒表达载体，病毒滴度为5×1010 ifu/L。重组慢病毒感染293T细胞可以检测到J441与FLAG标签融合基因的表达，初步预测J441在胞质中表达。
成功构建了J441-FLAG融合基因慢病毒表达载体，为进一步研究J441基因的相关功能提供了稳定转染载体，为揭示J441基因在T淋巴细胞白血病的发生发展过程中的重要作用奠定基础。
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T淋巴细胞白血病细胞株Jurkat经"高通量测序"得到基因表达数据，所得序列进行生物信息学分析：BLAST相似性分析结果证明一段编号为441、长1 785 bp的序列为新序列，开放阅读框(ORF)标签分析表明，该序列中存在一完整的长552 bp的编码区，编码含183个氨基酸的蛋白质，我们暂时将此段序列命名为J441。本实验的目的是构建T淋巴细胞白血病新基因J441与FLAG标签肽融合基因慢病毒载体，为进一步研究J441基因的相关功能提供了稳定转染载体，为揭示J441基因在T淋巴细胞白血病的发生发展过程中的重要作用奠定基础。
本研究中所用的第2代慢病毒载体系统pHAGE-CMV-MCS-IzsGreen、psPAX2和pMD2.G 3种质粒为南京医科大学免疫实验室赠送；T淋巴细胞白血病细胞株Jurkat细胞购于上海细胞库；1 000 bp DNA ladder Marker, XhloI，BamHI，Taq Master Mix和PrimeScript™ RT-PCR Kit Primer购于日本Takara公司；琼脂糖购于上海赛百盛公司；Plasmid Midi Kit和大肠杆菌感受态细胞DH5α购于德国Qiagen公司；Lipofeetamine 2000购于美国Invitrogen公司；DMSO购于上海生化试剂厂；胎牛血清和DMEM购于美国Gibco公司；胰酶购于上海碧云天公司；一抗兔源的抗FLAG单克隆抗体M2购于美国Cell Signaling公司；羊抗兔IgG-Cy3购于武汉博士德公司。
引物序列如下：Primer(＋)：5'-ATGTGGATCCTGAGAGTGCT-3'；Primer(-)：5'-CTAATATTTTAC GTC- TTTTCCCC-3'，引物送Invitrogen公司合成。以Jurkat细胞cDNA为模板，PCR扩增新基因ORF区。PCR反应体系由人16种组织cDNA各1 μL，Taq Master Mix 12.5 μL，ddH20 10.5 μL，上下游引物各0.5 μL，总体积25 μL。反应条件：94 ℃变性6 min，然后94 ℃ 30 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s扩增36个循环，最后72 ℃延伸8 min。扩增产物经20 g/L的琼脂糖凝胶电泳检测。
引物设计以J441为模版，取J441中ORF两端序列为引物3'序列，引物序列如下：Primer(＋)：5'-GCGCTCGAGGCCACCATGTGGATCCTGAGAGTGCT-3'(实线部分为XhLoI酶切位点，虚线部分为Kozak序列)；Primer (-)：5'-CGCGGATCCCTACTTGTCATCGTCGTCCTTGTAGTCGCCTCCATATTTTACGTCTTTT-CCCC-3'(实线部分为BamHI酶切位点，斜体部分为FLAG标签肽序列，虚线部分为连接目的基因序列和FLAG标签肽序列的Linker)，引物送美国Invitrogen公司合成。
以Jurkat细胞cDNA为模板，PCR扩增新基因ORF区。PCR反应体系由cDNA μL，Taq Master Mix 12.5 μL，ddH2O 10.5 μL，上下游引物各0.5 μL，总体积25 μL。反应条件：94 ℃变性6 min，然后94 ℃ 30 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s扩增36个循环，最后72 ℃延伸8 min。扩增产物经20 g/L的琼脂糖凝胶电泳检测，经检测正确的产物纯化回收备用。
使用XhloI和BamHI对该质粒和cDNA进行双酶切，酶切反应体系为：质粒2 μL，DNA 6 μL，10×Buffer 5 μL，XhloI 2.5 μL，BamHI 2.5 μL，ddH2O 35 μL，总体积50 μL。反应条件：37 ℃，1 h。
将上述经过XhloI和BamHI酶切的目的基因ORF片段连接入酶切表达载体。连接体系：T4 Buffer 2 μL，T4连接酶0.2 μL，目的片段2 μL，载体1 μL，加ddH2O使总体积达20 μL。反应条件：22 ℃，30 min。将连接产物转化大肠杆菌感受态细胞DH5a，37 ℃倒置过夜培养；次日挑取生长较好的菌斑加入含有氨苄西林(Amp)的LB液体培养基中，37 ℃，用振荡器170 r/min振荡过夜培养后，使用Plasmid Midi Kit抽提质粒并送美国Invitrogen公司测序。挑选测序结果正确的质粒备用。
经胰蛋白酶消化的呈对数生长期的293T细胞铺10 cm板，浓度为5×106细胞，37 ℃，50 mL/L CO2培养箱内培养，待细胞生长至60%左右汇合度时即可转染混合质粒。使用Lipofectamine™ 2000将pHAGE-ORF 6 μg，psPAX2 4.5 μg和pMD2.G 1.5 μg共转染293T细胞。培养8 h后换用100 g/L血清的完全培养基，继续培养72 h。转染72 h收集病毒上清液，450 nm的微孔过滤器过滤病毒液，取浓缩后的病毒液逐孔稀释滴度测定法在293T细胞中测定病毒滴度。
以重组慢病毒转染后的生长良好的293T细胞作为实验组，同时设立不含目的基因的空白病毒转染的293T细胞为对照组，检测FLAG标签肽在293T细胞中表达。收集上述2组细胞，按照Trizol试剂盒说明抽提细胞总RNA，按照PrimeScript™ RT-PCR Kit的操作说明进行反转录，引物序列为1.2.2中所提到的引物，PCR反应体系及条件同1.2.3。20 g/L的琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增结果，并将检测正确的结果送测序。另收集2组细胞，植入放置了盖玻片的6孔板中，37 ℃，500 mL/L CO2培养12 h后，显微镜下观察，将长满细胞的盖玻片取出。(1)40 mL/L甲醛，室温20 min，PBS漂洗3次；(2)1 mL/L Triton X-100，室温20 min，PBS漂洗3次；(3)30 mL/L H2O2，室温15 min，PBS漂洗3次；(4)100 mL/L山羊血清封闭液封闭1 h；(5)FLAG兔源抗体(1︰500)4 ℃孵育过夜，PBS漂洗3次；(6)cy3-羊抗兔IgG(1︰100)室温孵育1 h，PBS漂洗3次；(7)600 mL/L缓冲甘油封片后荧光显微镜下观察拍照。
对这段ORF区在NCBI中经BLAST比对后未发现同源序列，只与一段未命名的蛋白有99%的相似度，未命名蛋白较本研究的ORF区少一个丝氨酸。J441的ORF区在Jurkat细胞及人16种组织中的表达：以Jurkat细胞及人16种组织cDNA为模板，1.2.1引物PCR扩增新基因ORF区，电泳图谱见图1。J441的ORF区在各组织中的表达情况各不相同，Jurkat细胞中表达最明显。
Agarose gel electrophoresis of J441 in Jurkat and 16 kinds of human tissues
注：1：Jurkat细胞；2：肝；3：骨骼肌；4：胸腺；5：胰腺；6：卵巢；7：肺；8：脾；9：结肠；10：小肠；11：睾丸；12：胎盘；13：前列腺；14：心脏；15：脑；16：肾；17：白细胞 1：Jurkat；2：liver；3：skeletal muscle；4：thymus；5：pancreas；6：ovary；7：lung；8：spleen；9：colon；10：small intestine；11：testis；12：placenta；13：prostate；14：heart；15：brain；16：kidney；17：leukocyte
Agarose gel electrophoresis of J441 in Jurkat and 16 kinds of human tissues
以Jurkat细胞cDNA为模板，1.2.2引物PCR扩增新基因ORF区，产物为J441-FLAG，见图2。PCR产物的琼脂凝胶电泳可见一清晰的特异扩增条带，其大小为500～600 bp，与理论值相符合。以重组慢病毒转染后的Jurkat细胞cDNA为模板，1.2.2引物做PCR扩增，扩增产物为测序结果同J441中ORF区序列对比，未发现任何碱基位点突变。
Agarose gel electrophoresis of positive clone
Agarose gel electrophoresis of positive clone
以重组慢病毒转染后的Jurkat细胞cDNA为模板，1.2.2引物做PCR扩增，扩增产物测序图谱，见图3。可以看到从531位到554位即为FLAG序列，证明重组慢病毒可以成功感染Jurkat细胞。
Sequencing of positive clone
Sequencing of positive clone
重组慢病毒表达克隆的滴度为5×1010 ifu/L。
构建的慢病毒载体系统中的3种质粒共转染293T细胞48 h后，荧光显微镜下可见293T细胞表达绿色荧光，见图4。取浓缩纯化后的上清液感染293T细胞48 h后，荧光显微镜下可见293T细胞表达绿色荧光，见图5。
Fluorescent analysis of 293T cells 48 h after co-transfection(×400)
Microscopy of fluorescent protein expression in 293T in the control group(×400)
Fluorescent analysis of 293T cells 48 h after infection(×400)
Microscopy of fluorescent protein expression in 293T in the experimental group(×400)
Fluorescent analysis of 293T cells 48 h after co-transfection(×400)
Microscopy of fluorescent protein expression in 293T in the control group(×400)
Fluorescent analysis of 293T cells 48 h after infection(×400)
Microscopy of fluorescent protein expression in 293T in the experimental group(×400)
对照组293T细胞免疫荧光结果显示只有绿色荧光表达，无标记FLAG标签肽二抗的红色荧光的表达；实验组293T细胞免疫荧光结果显示红色荧光和绿色荧光均有表达，见图6, 图7。
对J441应用IntrProScean分析软件得到7个可能的蛋白功能域，结果见图8。
Function prediction of open reading frame
Function prediction of open reading frame
急性淋巴细胞白血病(acute lymphoblastic leukemia，ALL)是造血干细胞的恶性克隆性疾病[1]。因克隆中的白血病细胞增殖失控、分化障碍、凋亡受阻，而停滞在细胞发育的不同阶段所导致的恶性血液病。ALL是小儿恶性肿瘤中最常见的疾病，所占的比例为50%左右，其中T淋巴细胞白血病(acute T-cell lymphoblastic leukemia，T-ALL)在儿童ALL中占10%～15%[2,3]。ALL发病的确切分子机制目前尚未明了，故寻找新的白血病相关基因一直是研究的热点[4]。筛选出白血病细胞系中新的基因有可能会成为其发病机制研究的突破点和治疗的重要靶点。本研究前期实验发现Jurkat中新的基因序列，而新序列的功能研究需要一个稳定表达并且易于检测和追踪的载体，基于此项需要，本研究构建了带有FLAG标签的慢病毒载体。
慢病毒属于反转录病毒科，其突破了一般的反转录病毒载体只能感染分裂期细胞的局限性，可以感染并在非有丝分裂细胞中复制，且具有很高的外源基因的表达效率和生物安全性[5,6,7]，已成为基因功能研究和基因治疗的有力手段[8]。慢病毒基因组结构复杂，其含有3个结构基因gag，pol和env，4个辅助基因：vif，vpr，nef，vpu和2个调节基因：tat和rev[9]。慢病毒载体的构建原理就是将HIV-1基因组中含有包装、反转录和整合所需的顺式作用元件和编码反式作用蛋白的序列进行分离，即将3个结构基因分别构建在2个质粒上，一个表达gag和pol，另一个表达env，同样的原理，也可以构建三质粒表达系统[10,11]。本研究中慢病毒载体的包装系统即为三质粒表达系统：转移质粒pHAGE-CMV-MCS-IzsGreen、包装质粒psPAX2和包膜质粒pMD2.G。重组慢病毒使用瞬时转染法，即将包装结构和载体结构瞬时共转染高表达细胞系如293T而产生重组慢病毒，然后重组慢病毒分泌到培养基中即得到载体慢病毒。本研究成功构建了J441慢病毒载体质粒pHAGE-J441-FLAG，并建立了慢病毒过表达系统。采用的工具细胞293T细胞能够产生高滴度的病毒颗粒，病毒滴度可达5×1010 ifu/L；以FLAG标记抗体对重组慢病毒质粒转染的293T细胞行细胞免疫荧光检测，可预测J441在靶细胞中的表达位于胞质。本研究选定J441的ORF区为研究对象主要有2个方面原因：(1)新基因J441全长尚未知；(2)短序列便于构建慢病毒载体，便于后续研究的开展。
FLAG标签作为一种由8个氨基酸残基DYKDDDDK组成的表位标志物，具有序列简短，可以与特异性抗体结合，融合表达后对目标蛋白的结构和生物活性影响小，可以用1条人工合成的寡聚核苷酸来编码的特点使其得到广泛的应用。FLAG基因与目的基因组成融合基因，两者互不影响，共同表达FLAG标签肽和目的蛋白组成的融合蛋白。研究发现融合蛋白的功能及定位不会被这些小的多肽标签影响[12,13]，而且可以被抗FLAG抗体识别，以便于进行鉴定和检测[14,15]。本研究中，在引物上引入FLAG标签及酶切位点BamH I和XhloI，通过PCR反应扩增出J441-FLAG重组基因后，双酶切PCR产物和空载体pHAGE-CMV-MCS-IzsGreen，用T4 DNA连接酶进行连接，构建重组质粒pHAGE-J441-FLAG。用PCR扩增、双酶切的方法对重组质粒进行鉴定，鉴定结果均为阳性的重组质粒进行DNA测序鉴定，测序结果表明重组质粒pHAGE-J441-FLAG构建成功。
本研究通过引入的多克隆位点构建了J441-FLAG标签的真核表达载体，可直接定向将新序列片段从Jurkat细胞连接到其他目的细胞中，省去了重新PCR过程，避免了编码序列在PCR过程中造成的移码和错义突变[16]。该载体在细胞中可高效表达，可以将原本细胞内基因功能放大，便于功能预测及分析。本研究使用了FLAG标签抗体，其特异性较好，使用广泛，并能有效分辨目的基因在细胞内的定位，通过检测标签直观观察病毒携带基因的表达，为新基因功能的研究提供了更方便的工具。
