李超; 钱新华; 千新来; 付琳琳; 王虹

doi:10.3760/cma.j.issn.2095-428X.2014.12.015

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• 实验研究 •

黄芪多糖对人红白血病K562细胞增殖的抑制作用及机制

中华实用儿科临床杂志, 2014,29(12) : 936-939. DOI: 10.3760/cma.j.issn.2095-428X.2014.12.015

摘要

目的

研究黄芪多糖(APS)对人红白血病K562细胞增殖的抑制作用及机制。

方法

用不同质量浓度APS(0 mg/L、100 mg/L、200 mg/L和400 mg/L)处理K562细胞(购于中科院上海细胞库)后，通过四甲基偶氮唑盐(MTT)法观察APS对K562细胞生长速度和倍增时间的影响，通过流式细胞术检测APS对K562细胞周期分布的影响，通过反转录－聚合酶链反应(RT－PCR)和Western blotting方法检测细胞周期蛋白A(Cyclin A)、细胞周期蛋白B(Cyclin B)、细胞周期蛋白E(Cyclin E)和p21基因在mRNA和蛋白水平的表达。

结果

MTT结果显示：与对照组相比，100 mg/L、200 mg/L和400 mg/L APS处理的K562细胞生长速度均明显减慢(P均<0.01)，倍增时间显著延长(P均<0.01)。流式细胞术检测周期分布结果显示：与对照组相比，APS组K562细胞G1期细胞显著增多，差异有统计学意义(P<0.01)，而S期和G2/M期细胞显著减少，差异有统计学意义(P<0.01)。RT－PCR和Western blotting结果显示：与对照组相比，APS组K562细胞中Cyclin B和Cyclin E在mRNA和蛋白的表达均显著降低，差异均有统计学意义(P均<0.01)；p21在mRNA和蛋白的表达均显著增加，差异均有统计学意义(P均<0.01)；而Cyclin A在mRNA和蛋白的表达差异均无统计学意义(P均>0.05)。

结论

APS能够显著抑制人红白血病K562细胞的增殖能力，APS可能是通过下调Cyclin B和Cyclin E的表达及上调p21的表达而抑制K562细胞的增殖能力。

引用本文: 李超, 钱新华, 千新来, 等. 黄芪多糖对人红白血病K562细胞增殖的抑制作用及机制 [J] . 中华实用儿科临床杂志, 2014, 29(12) : 936-939. DOI: 10.3760/cma.j.issn.2095-428X.2014.12.015.

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白血病(leukemia)是严重危害人类健康的常见恶性肿瘤之一，至今尚无有效的治疗方法，增殖失控是白血病细胞重要的生长特点之一^[1]。中药的抗肿瘤作用正逐步受到重视，且其具有毒副作用较少、患者易于接受等优点^[2,3]。近年来，研究者们已经发掘出一些具有抗癌活性的中药^[4,5]。黄芪的药用部分为其干燥的根。黄芪多糖(astragalus polysaccharide，APS)是黄芪的主要活性成分之一^[6,7]，研究表明，APS具有增强机体免疫功能、强心降压、降血糖、抗应激、抗病毒、抗辐射、抗氧化、抗肿瘤(如肝癌、胃癌、结肠癌、肺癌、鼻咽癌、乳腺癌和S180肉瘤)等多种药理功效^{[6,7,8,9,10,11,12,13]}。本研究通过四甲基偶氮唑盐(methyl thiazolyl tetra－zolium，MTT)法观察APS对K562细胞生长速度和倍增时间的影响，通过流式细胞术检测APS对K562细胞周期分布的影响，通过反转录－聚合酶链反应(RT－PCR)和Western blotting方法检测细胞周期蛋白A(Cyclin A)、细胞周期蛋白B(Cyclin B)、细胞周期蛋白E(Cyclin E)和p21基因在mRNA和蛋白水平的表达，以期为APS用于白血病的治疗提供依据。

1　材料与方法

1.1　材料与试剂

1.1.1　细胞系

人红白血病K562细胞购自中科院上海细胞库。人红白血病K562细胞培养条件：用含体积分数10%胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)和青/链霉素(青霉素100 000 U/L，链霉素100 mg/L)的RPMI－1640培养基，于37 ℃、体积分数50 mL/L CO₂细胞培养箱中培养。

1.1.2　主要试剂

FBS为杭州四季青公司产品；APS为实验室提取和保存；RPMI－1640培养基、Trizol试剂、100 bp DNA分子质量Markers、MTT为美国Invitrogen产品；RT－PCR试剂盒、Taq DNA聚合酶为日本TaKaRa公司产品；兔抗人Cyclin A多克隆抗体(IgG)、兔抗人Cyclin B多克隆抗体(IgG)、兔抗人Cyclin E多克隆抗体(IgG)、鼠抗人p21单克隆抗体(IgG)、鼠抗人β－actin单克隆抗体、辣根酶标记的山羊抗兔二抗、辣根酶标记的兔抗鼠二抗及增强化学发光(enhanced chemiluminescence，ECL)试剂盒均为美国Santa Cruz公司产品；PCR引物由英潍捷基上海公司合成。

1.2　方法

1.2.1　MTT法检测细胞生长速度和倍增时间

收集并计数K564细胞，按5 × 10³/孔接种细胞，常规培养24 h后，更换培养基为含不同质量浓度APS(0 mg/L、100 mg/L、200 mg/L和400 mg/L)的培养基，其中0 mg/L组为对照组，余为实验组。各组各时间点均设3个复孔。分别于加药后1 d、2 d、3 d、4 d和5 d，将5 g/L的MTT溶液加入待测样品孔中(20 μL/孔)，孵育4 h，弃上清，每孔加入200 μL的二甲亚砜，酶标仪上测定OD₄₉₀值，每组测定3孔，求均值。实验重复3次。以OD₄₉₀值为纵坐标、培养时间(d)为横坐标绘制细胞生长曲线，按公式TD ＝ t × log2/(logNt－logN0)计算倍增时间(其中TD为倍增时间，t为Nt和N0间隔时间，N0为起始时间OD₄₉₀值，Nt为培养t小时后OD₄₉₀值)。

1.2.2　流式细胞术测定细胞周期变化

收集K562细胞和APS(200 mg/L)处理48 h的K562细胞。用700 mL/L(V/V)乙醇于4 ℃固定细胞过夜。预冷的PBS洗细胞3次。加200 μL核糖核酸酶A(1 g/L)，37 ℃孵育30 min后，加入800 μL碘化丙啶染色液(100 μg/L)混匀，4 ℃避光静置30 min后进行检测，使用Coulter－profilo II(Coulter Co)型流式细胞仪测定DNA水平，分析细胞周期分布直方图。

1.2.3　RT－PCR法检测细胞增殖相关基因mRNA水平表达的变化

提取细胞总RNA并定量，合成cDNA第1条链后，以cDNA为模板进行PCR反应。以甘油醛－3－磷酸脱氢酶(glyceraldehyde－3－phosphate dehydrogease，GAPDH)为内参照。引物序列和目的片段长度见表1。通过Bandleader 3.0软件分析PCR目的条带与内参照条带的灰度比值。

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表1

引物序列和目的片段长度

Table 1

Sequence of primer and size of objective fragment

表1

引物序列和目的片段长度

Table 1

Sequence of primer and size of objective fragment

基因	上游引物	下游引物	目的片段长度
Cyclin A	5'－attcatctctcctctccca－3'	5'－gttggtggttggtactgt－3'	473 bp
Cyclin B	5'－caggttgttgcaggagac－3'	5'－ttgagaaggaggaaagtgc－3'	382 bp
Cyclin E	5'－tggtatacttgctgcttcgg－3'	5'－cgctgccctgcttcttacc－3'	329 bp
p21	5'－gtgatgcgctaatgg－3'	5'－aatctgtcatgctggtctgc－3'	352 bp
GAPDH	5'－aatcccatcaccatcttcca－3'	5'－cctgcttcaccaccttcttg－3'	580 bp

注：GAPDH：甘油醛－3－磷酸脱氢酶　GAPDH：glyceraldehyde－3－phosphate dehydrogease

1.2.4　Western blotting法检测细胞增殖相关基因蛋白水平表达的变化

提取细胞总蛋白并定量，变性后通过Western blotting方法检测细胞增殖相关基因蛋白水平表达的变化。以β－actin为内参照，上样量为100 μg。兔抗人Cyclin A多克隆抗体、兔抗人Cyclin B多克隆抗体、兔抗人Cyclin E多克隆抗体、鼠抗人p21单克隆抗体、鼠抗人β－actin单克隆抗体、辣根酶标记的山羊抗兔二抗和辣根酶标记的兔抗鼠二抗稀释倍数分别如下：1∶100、1∶150、1∶100、1∶150、1∶300、1∶2 500和1∶2 500。通过Bandscan 5.0软件分析Western blotting条带灰度与内参照条带灰度比值。

1.3　统计学处理

采用SPSS 17.0软件进行分析。计量资料用±s表示。2个样本均数比较采用t检验。多个样本均数比较采用单向方差分析(One－Way ANOVA)，方差齐时多重比较采用LSD法检验，方差不齐时方差分析采用近似F检验Welch法，多重比较采用Dunnett's T3法检验。检验水准为α＝0.05。

2　结果

2.1　APS对K562细胞增殖的影响

2.1.1　APS对K562细胞生长速度和倍增时间的影响

MTT比色法绘制细胞生长曲线并计算倍增时间，结果显示：与对照组K562细胞(0 mg/L APS)相比，100 mg/L、200 mg/L和400 mg/L APS处理的K562细胞生长速度均明显减慢(P均<0.01)，倍增时间显著延长(P均<0.01)，见图1、表2。根据上述实验结果并结合实验中观察到的细胞状态，后续实验中均以200 mg/L的APS诱导48 h的K562细胞为实验组，以不加药的K562细胞为对照组。

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图1

黄芪多糖对K562细胞生长速度的影响

Figure 1

Effects of astragalus polysaccharide on the growth rate of K562 cells

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图1

黄芪多糖对K562细胞生长速度的影响

Figure 1

Effects of astragalus polysaccharide on the growth rate of K562 cells

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表2

黄芪多糖对K562细胞倍增时间的影响(h，±s)

Table 2

Effects of astragalus polysaccharide on the doubling time of K562 cells(h，±s)

表2

黄芪多糖对K562细胞倍增时间的影响(h，±s)

Table 2

Effects of astragalus polysaccharide on the doubling time of K562 cells(h，±s)

组别	倍增时间
对照组	26.050±2.655
100 mg/L黄芪多糖组	69.705±2.546
200 mg/L黄芪多糖组	113.981±6.095
400 mg/L黄芪多糖组	431.133±22.748
F值	716.223
P值	0.000

注：各组之间倍增时间相比，P均<0.01　Comparison of doubling time among every group，allP<0.01

2.1.2　APS对K562细胞周期的影响

流式细胞术检测细胞周期分布结果显示：与对照组相比，实验组G1期细胞显著增多(P<0.01)，而S期和G2/M期细胞显著减少(P<0.01)，见表3。

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表3

黄芪多糖对K562细胞周期分布的影响(%，±s)

Table 3

Effects of astragalus polysaccharide on the cell cycle distribution of K562 cells(%，±s)

表3

黄芪多糖对K562细胞周期分布的影响(%，±s)

Table 3

Effects of astragalus polysaccharide on the cell cycle distribution of K562 cells(%，±s)

组别	G1期	S期	G2/M期
对照组	54.255±3.434	36.394±2.589	9.351±0.588
实验组	79.221±3.620	15.851±1.759	4.928±0.245
t值	8.667	11.367	12.018
P值	0.001	0.000	0.000

2.2　APS抑制K562细胞增殖的机制

2.2.1　APS对K562细胞中Cyclin A、Cyclin B、Cyclin E和p21基因mRNA水平表达的影响

RT－PCR结果显示：与对照组相比，实验组K562细胞中Cyclin B和Cyclin E在mRNA水平的表达均显著降低，差异均有统计学意义(P均<0.01)；而p21在mRNA水平的表达均显著增加，差异均有统计学意义(P均<0.01)；Cyclin A在mRNA水平的表达差异均无统计学意义(P均>0.05)，见图2、表4。

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图2

黄芪多糖对K562细胞中细胞周期蛋白A基因、细胞周期蛋白B基因、细胞周期蛋白E基因和p21 mRNA表达的影响

Figure 2

Effects of astragalus polysaccharide on the expression of Cyclin A、Cyclin B、Cyclin E and p21 mRNA in K562 cells

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注：M：100 bp DNA Markers；1：对照组；2：实验组　M：100 bp DNA Markers；1：control group；2：experimental group

图2

黄芪多糖对K562细胞中细胞周期蛋白A基因、细胞周期蛋白B基因、细胞周期蛋白E基因和p21 mRNA表达的影响

Figure 2

Effects of astragalus polysaccharide on the expression of Cyclin A、Cyclin B、Cyclin E and p21 mRNA in K562 cells

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表4

黄芪多糖对K562细胞中Cyclin A、Cyclin B、Cyclin E和p21 mRNA表达的影响(±s)

Table 4

Effects of astragalus polysaccharide on the expression of Cyclin A、Cyclin B、Cyclin E and p21 mRNA in K562 cells(±s)

表4

黄芪多糖对K562细胞中Cyclin A、Cyclin B、Cyclin E和p21 mRNA表达的影响(±s)

Table 4

Effects of astragalus polysaccharide on the expression of Cyclin A、Cyclin B、Cyclin E and p21 mRNA in K562 cells(±s)

相对值	对照组	实验组	t值	P值
Cyclin A/GAPDH	0.292±0.017	0.299±0.013	0.598	0.582
Cyclin B/GAPDH	1.001±0.096	0.226±0.017	13.757	0.000
Cyclin E/GAPDH	0.831±0.042	0.270±0.024	20.101	0.000
p21/GAPDH	0.135±0.016	0.328±0.034	8.883	0.001

注：Cyclin：细胞周期蛋白；GAPDH：甘油醛－3－磷酸脱氢酶　GAPDH：glyceraldehyde－3－phosphate dehydrogenase

2.2.2　APS对K562细胞中Cyclin A、Cyclin B、Cyclin E和p21基因在蛋白水平表达的影响

Western blotting结果显示：与对照组相比，实验组K562细胞中Cyclin B和Cyclin E在蛋白水平的表达均显著降低，差异均有统计学意义(P均<0.01)；而p21在蛋白水平的表达均显著增加，差异均有统计学意义(P均<0.01)；Cyclin A在蛋白水平的表达差异均无统计学意义(P均>0.05)，见图3、表5。

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图3

黄芪多糖对K562细胞中Cyclin A、Cyclin B、Cyclin E和p21蛋白表达的影响

Figure 3

Effects of astragalus polysaccharide on the expression of Cyclin A、Cyclin B、Cyclin E and p21 protein in K562 cells

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注：1：对照组；2：实验组；Cyclin：细胞周期蛋白　1：control group；2：experimental group

图3

黄芪多糖对K562细胞中Cyclin A、Cyclin B、Cyclin E和p21蛋白表达的影响

Figure 3

Effects of astragalus polysaccharide on the expression of Cyclin A、Cyclin B、Cyclin E and p21 protein in K562 cells

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表5

黄芪多糖对K562细胞中Cyclin A、Cyclin B、Cyclin E和p21蛋白表达的影响(±s)

Table 5

Effects of astragalus polysaccharide on the expression of Cyclin A、Cyclin B、Cyclin E and p21protein in K562 cells(±s)

表5

黄芪多糖对K562细胞中Cyclin A、Cyclin B、Cyclin E和p21蛋白表达的影响(±s)

Table 5

Effects of astragalus polysaccharide on the expression of Cyclin A、Cyclin B、Cyclin E and p21protein in K562 cells(±s)

相对值	对照组	实验组	t值	P值
Cyclin A/β－actin	0.311±0.022	0.321±0.019	0.575	0.596
Cyclin B/β－actin	0.266±0.023	0.079±0.017	11.466	0.000
Cyclin E/β－actin	0.322±0.036	0.086±0.010	11.575	0.000
p21/β－actin	0.103±0.008	0.271±0.023	12.144	0.000

注：Cyclin：细胞周期蛋白

3　讨论

黄芪属豆科黄芪属植物，我国药典规定药用黄芪有两种：蒙古黄芪与膜荚黄芪。黄芪药用部分是其干燥根，黄芪味甘、性温、有补气升阳、固表止汗、托脓排毒和生肌的功效^[6,7]。APS是黄芪的主要活性成分之一。本研究探讨APS对人红白血病K562细胞增殖的抑制作用及机制，以期为APS用于白血病的治疗提供依据。

生长速度、倍增时间和细胞周期分布等是体外评价肿瘤细胞恶性生物学行为的良好指标。本研究结果显示，与对照组相比，100 mg/L、200 mg/L和400 mg/L APS处理的K562细胞生长速度均明显减慢(P<0.01)，倍增时间显著延长(P<0.01)；APS组K562细胞G1期细胞显著增多(P<0.01)，而S期和G2/M期细胞显著减少(P<0.01)。说明APS能够显著抑制K562细胞的增殖。

哺乳动物细胞中已有20多种Cyclins被鉴定，其中Cyclin A、B、C、D和E等对细胞周期时相转换具有重要的调控作用，与细胞增殖、分化和肿瘤的发生密切相关^[14,15]。Cyclins可与细胞周期蛋白依赖性激酶(cyclin－dependent kinases，CDKs)形成复合物，从而调控细胞周期的进程^[14,15]，其中Cyclin E等在G1期和G1/S转换中起重要调控作用，而Cyclin A和Cyclin B等是G2/M转换和有丝分裂期的重要调控因子^[16,17]。p21是细胞周期依赖性蛋白激酶抑制因子(cyclin－dependent kinase inhibitor，CDKIs)家族重要成员之一，对细胞增殖发挥抑制作用^{[18,19,20,21]}。本研究显示：与对照组相比，APS组K562细胞中Cyclin B和Cyclin E在mRNA水平和蛋白水平的表达均显著降低(P均<0.01)，而p21在mRNA水平和蛋白水平的表达均显著增加(P均<0.01)，Cyclin A在mRNA水平和蛋白水平的表达差异均无统计学意义(P均>0.05)。提示APS抑制K562细胞增殖的分子机制可能是APS通过上调p21基因表达，进而抑制Cyclin E/CDK2活性，从而使细胞周期阻滞在G1期，同时APS诱导CyclinE表达下降对此也有重要作用，另外G2/M期细胞比例显著减少的原因可能与APS抑制Cyclin B的表达有关。但是，APS抑制K562细胞增殖的分子机制较复杂，值得进一步深入研究。

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贡献者信息

李超

新乡医学院病理学教研室

钱新华

510515　广州，南方医科大学南方医院新生儿科

千新来

新乡医学院病理学教研室

付琳琳

新乡医学院病理学教研室

王虹

新乡医学院病理学教研室

通信作者

钱新华

510515　广州，南方医科大学南方医院新生儿科

Email：qxh_nfyy@163.com

关键词

白血病; 黄芪多糖; 增殖; 细胞周期蛋白; p21;

历史

出版日期：2014-06-20

收稿日期：2014-04-20

本文编辑

周二强

Experimental Study

Inhibitory effect of astragalus polysaccharide on the proliferation of human erythroleukemia K562 cells and its mechanisms

Chao Li, Xinhua Qian, Xinlai Qian, Linlin Fu, Hong Wang

Published 2014-06-20

Cite as Chin J Appl Clin Pediatr, 2014, 29(12): 936-939. DOI: 10.3760/cma.j.issn.2095-428X.2014.12.015

Abstract

Objective

To explore the inhibitory effect of astragalus polysaccharide (APS) on the proliferation of human erythroleukemia K562 cells and its mechanisms.

Methods

After K562 cells (purchased from Shanghai cell bank of chinese academy of science) were treated with different concentrations (0 mg/L, 100 mg/L, 200 mg/L and 400 mg/L) of APS.The influences of APS on the growth rate, doubling time and cell cycle distribution of K562 cells were observed by methyl thiazolyl tetra-zolium assay(MTT)and flow cytometry, respectively.Furthermore, the reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) and Western blotting assay were used to detect the expressions of Cyclin A, Cyclin B, Cyclin E and p21 gene at the mRNA and protein levels, respectively.

Results

MTT assay findings showed that, compared to the control group (0 mg/L APS), growth rates of K562 cells treated with 100 mg/L, 200 mg/L and 400 mg/L APS decreased significantly (all P<0.01), and the doubling times lengthened significantly (all P<0.01). Flow cytometry findings revealed that, compared to the control group, the G1 phase cells in K562 cells of APS group increased significantly (P<0.01), while the S and G2/M phase cells decreased significantly (all P<0.01). RT-PCR and Western blotting results indicated that Cyclin B and Cyclin E expression of K562 cells at the mRNA and protein levels in the APS group were significantly lower than those of the control group(all P<0.01), whereas p21 expression was significantly enhanced at mRNA and protein levels (P<0.01), and Cyclin A expression was not significantly different at mRNA and protein levels between the 2 groups(all P>0.05).

Conclusions

APS could inhibit the proliferation of human erythroleukemia K562 cells.APS could inhibit the proliferation of K562 cells by down-regulating the expression of Cyclin B and Cyclin E and up-regulating the expression of p21.

Key words:

Leukemia; Astragalus polysaccharide; Proliferation; Cyclin; p21

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Chao Li

Department of Neonatology, Nanfang Hospital, Southern Medical University, Guangzhou 510515, China

Xinhua Qian

Xinlai Qian

Linlin Fu

Hong Wang

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