观察维生素D(VitD)对内皮细胞一氧化氮(NO)生成的影响，以及诱导NO释放的可能信号途径。
人脐静脉内皮细胞(HUVEC)与不同浓度VitD(0 mmol/L、0.01 mmol/L、0.10 mmol/L、1.00 mmol/L、10.00 mmol/L)一起培养60 min；与1.00 mmol/L VitD分别培养不同的时间(30 min、60 min、90 min、120 min)；加入VitD受体(VDR)激动剂(ZK191784)或拮抗剂(ZK159222)培养60 min。NO荧光探针检测试剂盒(DAF-FM DA)检测细胞培养上清液NO水平。HUVEC和VitD一起培养，加入VDR受体激动剂或拮抗剂分别培养60 min，Western blot测定小窝蛋白(Caveolin-1)和内皮型NO合酶(eNOS)蛋白的表达及磷酸化水平。
VitD浓度依赖性增加内皮细胞NO的生成，在浓度为1.0 mmol/L作用60 min产生最大效应。VDR激动剂或拮抗剂预处理内皮细胞可增加或抑制VitD诱导NO生成。VitD和VDR激动剂保持Caveolin-1在正常的低磷酸化水平，增加eNOS的磷酸化水平，而VDR拮抗剂增加Caveolin-1磷酸化，降低eNOS的磷酸化水平。
VitD能通过VDR明显诱导内皮细胞NO生成。VitD与VDR相互作用维持Caveolin-1的低磷酸化水平，导致eNOS激活，NO生成增加。
版权归中华医学会所有。
未经授权，不得转载、摘编本刊文章，不得使用本刊的版式设计。
除非特别声明，本刊刊出的所有文章不代表中华医学会和本刊编委会的观点。
一氧化氮(nitric oxide，NO)是血管代谢中的关键调节因子，血管中NO生物活性降低被认为是导致心血管疾病的主要原因，血管内皮是血管内产生活性NO的唯一来源[1]。内皮功能障碍是心血管疾病的重要启动因素，突出表现为内皮依赖性血管舒张功能障碍，主要由NO产生减少和活性氧簇(ROS)生成增多所致。内皮细胞合成NO是通过内皮型NO合酶(eNOS)，NO和eNOS在调节内皮活性上起重要作用。
维生素D(VitD)是一种作用广泛的维生素，不仅参与机体钙磷代谢，还对高血压、心力衰竭、糖尿病等发挥重要调节作用。VitD不足是心肌梗死及心血管疾病的危险因素[2]。Meta分析显示，血中25(OH)D降低与高血压、高血糖、糖尿病及外周血管疾病密切相关[3]。内皮细胞胞内存在VitD受体(VDR)，可表达1α羟化酶mRNA和蛋白质，可以合成VitD，内皮细胞共存1α羟化酶和VDR可能为VitD通过自分泌/旁分泌机制调节内皮功能提供了基础[4]。但VitD对心血管的保护作用是否与其促进内皮NO合成有关，目前知之甚少。本研究在培养的人脐静脉血内皮细胞(HUVEC)中观察VitD对NO生成及可能机制，并进行探讨。
HUVEC从出生新生儿脐带血10～15 mL中分离，细胞分离培养见文献报道[5]，简述如下：HUVEC接种于1 g/L明胶包被的培养瓶中，加入含内皮生长介质2(EGM-2)培养液，并与人表皮生长因子(hEGF)、氢化可的松、庆大霉素、两性霉素B、20 mL/L胎牛血清(FBS)，血管内皮生长因子(VEGF)，碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)，重组人胰岛素样生长因子1、抗坏血酸、肝素、2 mmol/L谷氨酰胺、10 g/L青霉素、链霉素，置于37 ℃ 50 g/L的CO2培养箱内，细胞生长约80%融合后，以0.5 g/L胰蛋白酶＋0.2 g/L EDTA消化传代。细胞形态学及对细胞内Ⅷ因子进行免疫细胞化学染色来鉴定是否为HUVEC，第2、3代用于实验。细胞培养如下：HUVEC分别与0 mmol/L、0.01 mmol/L、0.10 mmol/L、1.00 mmol/L、10.00 mmol/L VitD培养60 min；与1.00 mmol/L VitD培养不同时间(30 min、60 min、90 min、120 min)，测定细胞培养上清液NO水平。细胞分组如下：HUVEC＋0 mmol/L VitD培养(对照组)、HUVEC＋1.00 mmol/L VitD培养(用乙醇溶解)(VitD组)、HUVEC＋1.00 mmol/L VitD＋VDR受体激动剂ZK191784(1.00 mmol/L)(VitD＋ZK19组)、HUVEC＋1.00 mmol/L VitD＋拮抗剂ZK159222(1.00 mmol/L)(VitD＋ZK15组)分别培养60 min，测定上清液NO水平，终止培养，收集细胞，蛋白印迹测定小窝蛋白(Caveolin-1)和eNOS蛋白表达及磷酸化水平(P-caveolin-1，P-eNOS)。新生儿脐带血的采集经医院伦理委员会审批同意，家属签知情同意书。VitD、DMEM培养基、ZK191784、ZK159222购自美国Sigma公司。
1×105细胞接种于明胶包被24孔培养板，细胞附壁后在EGM-2介质孵育，后在DMEM培养基中培养4～6 h，加入2 mmol/L的谷氨酰胺和10 g/L青霉素，并不含FBS及苯酚。在细胞培养上清液中加用等体积格里斯(Griess)试剂，随后按NO荧光探针检测试剂盒(DAF-FM DA)说明进行操作。NO荧光探针检测试剂盒购自南京恩晶生物科技有限公司。
PBS清洗细胞，过夜，用NO检测试剂活化细胞，原钒酸钠和PBS冰水液洗涤，RIPA裂解液裂解细胞，4 ℃ 12 000×g离心30 min，提取细胞总蛋白。BCA试剂盒测定测定总蛋白浓度，在95 ℃加热5 min预变性，30 μg的样品上样，十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳分离，转移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜，50 g/L脱脂奶粉封闭2 h，分别加入一抗(兔Caveolin-1或P-Caveolin-1、P-eNOS或eNOS单克隆抗体)，4 ℃过夜，加辣根过氧化物酶标记的二抗37 ℃孵育1 h。利用UVP化学荧光成像系统(ChemiDoc-It™600 Imaging System)进行化学发光显影，以β-actin作为内参。P-Caveolin-1和Caveolin-1，P-eNOS和eNOS抗体购自美国Cell Signaling公司。
采用SPSS 17.0统计软件完成数据的统计分析。计量资料采用
±s表示，多组比较采用One-Way ANOVA方差分析，两两比较方差齐者采用LSD法，方差不齐者采用Dunnett's T3检验。P<0.05为差异有统计学意义。
浓度0 mmol/L、0.01 mmol/L、0.10 mmol/L、1.00 mmol/L、10.00 mmol/L VitD与HUVEC一起培养60 min诱导上清液NO生成水平不同，差异有统计学意义(F＝51.84，P＝0.00)。随着VitD浓度增加，细胞培养上清液NO浓度亦增加，见图1。1.00 mmol/L VitD与HUVEC培养30 min、60 min、90 min、120 min，VitD诱导NO生成水平不同，差异有统计学意义(F＝41.13，P＝0.000)，最大生成效应在60 min，60 min后NO生成呈下降趋势，见图2。
注：与0 mmol/L组比较，aP<0.01；与0.01 mmol/L及0.10 mmol/L组比较，bP<0.01，n＝5 Compared with 0 mmol/L group，aP<0.01；compared with 0.01 mmol/L and 0.10 mmol/L group，bP<0.01，n＝5
注：与0 mmol/L组比较，aP<0.01；与30 min组比较，bP<0.01；与60 min组比较，cP<0.05，n＝5 compared with 0 mmol/L group，*P<0.01；compared with 30 min group，bP<0.01，compared with 60 min group，cP<0.05，n＝5
VitD单用诱导NO释放为(48.40±6.34) μmol/L，较对照组[(20.30±2.07) μmol/L]升高，差异有统计学意义(P＝0.000)。VitD＋ZK19使NO生成量骤然上升，达(58.34±5.05) μmol/L，较VitD组增加20.53%，差异有统计学意义(P＝0.003)。VitD＋ZK15组[(40.7±3.52) μmol/L]较VitD组诱导NO生成效应减少(P＝0.016)，较VitD＋ZK19组明显减少(P＝0.000)。
与对照组相比，VitD组、VitD＋ZK19组及VitD＋ZK15组Caveolin-1的表达未见明显改变；VitD组、VitD＋ZK19组P-Caveolin-1与Caveolin-1的比值亦无明显改变(P＝0.638、0.813)，而ZK15明显增加P-Caveolin-1/Caveolin-1(P＝0.000)。与对照组相比，VitD、VitD＋ZK19、VitD＋ZK15三组eNOS的表达亦未见明显改变，给予VitD或VitD＋ZK19组明显增加P-eNOS/eNOS(P<0.01)，而VitD＋ZK15组P-eNOS/eNOS无明显增加(P＝0.337)。与VitD组相比，VitD＋ZK19组P-eNOS/eNOS明显增加，差异有统计学意义(P＝0.029)，见图3、图4，表1。
对照组、VitD组、VitD＋ZK19组和VitD＋ZK15组P-Caveolin-1/Caveolin-1及P-eNOS/eNOS水平的比较(
±s)
Comparison of P-Caveolin-1/Caveolin-1 and P-eNOS/eNOS in the control group，VitD group，VitD＋ZK19 group and VitD＋ZK15 group(
±s)
对照组、VitD组、VitD＋ZK19组和VitD＋ZK15组P-Caveolin-1/Caveolin-1及P-eNOS/eNOS水平的比较(±s)
Comparison of P-Caveolin-1/Caveolin-1 and P-eNOS/eNOS in the control group，VitD group，VitD＋ZK19 group and VitD＋ZK15 group(±s)
| 组别 | 例数 | P-Caveolin-1/Caveolin-1 | P-eNOS/eNOS |
|---|---|---|---|
| 对照组 | 5 | 0.22±0.05 | 0.23±0.07 |
| VitD组 | 5 | 0.24±0.06 | 0.53±0.10a |
| VitD＋ZK19组 | 5 | 0.23±0.06 | 0.68±0.13ad |
| VitD＋ZK15组 | 5 | 0.44±0.09abc | 0.29±0.09c |
| F值 | 12.76 | 22.62 | |
| P值 | 0 | 0 |
注：eNOS：内皮型NO合酶；与对照组比较，aP<0.01；与VitD组比较，bP<0.01，dP<0.05；与VitD＋ZK191784组比较，cP<0.01 eNOS：endothelial nitric oxide synthase；compared with control group，aP<0.01；compared with VitD group，bP<0.01，dP<0.05；compared with VitD＋ZK191784 group，cP<0.01
血管内皮细胞损伤在动脉粥样硬化过程中起重要作用，NO生成减少是内皮功能损伤的主要标志，与内皮功能失调、胰岛素对抗、心血管重构密切相关[6]。NO是一种内皮源性舒张因子，具有松弛血管平滑肌细胞、抗动脉粥样硬化、抑制血小板黏附和血栓形成等，吸入NO可选择性地降低肺血管阻力、改善肺的氧合功能，是治疗新生儿持续性肺动脉高压有效方法之一。eNOS是内皮细胞促进NO生成的关键酶，参与某些血管疾病如动脉粥样硬化和高血压的发病机制[7]。
VitD是儿童基本的营养素，其缺乏导致全身整体代谢异常，与多种儿童疾病如骨骼、心血管、先天性心脏病、肾脏[8]、小儿肥胖[9]、糖尿病等关系密切。在心血管系统中，VitD能负向调节肾素血管紧张素活性，VitD不足易患高血压、左心室肥厚、心力衰竭等[10]。在高血压患者，给予VitD治疗可以降低血压，改变心力衰竭患者的细胞因子[11]。本研究显示，VitD能刺激内皮细胞NO生成，这种效应与剂量有关，且诱导NO释放的最大效应在60 min，似乎是通过非受体介导的非基因效应起作用。本结果提示，VDR激动剂增加VitD诱导NO释放效应，VDR拮抗剂则抑制VitD诱导NO的释放，提示VitD主要通过与VDR结合促进NO的生成，而并非通过非受体途径起作用。
小窝(Caveolae)是一类特定的脂筏结构，而Caveo-lin-1是Caveolae的重要结构和功能蛋白，参与Caveolae的形成、细胞增殖、分化、凋亡以及多种信号通路的调控[12]。近年来有研究证实，Caveolin-1在正常情况下保持低磷酸化水平，在血管内皮细胞中表达。Caveolin-1是eNOS的负调控蛋白，细胞内钙离子浓度增加为激活eNOS的重要条件[13]。本结果提示，VitD和VDR激动剂保持Caveolin-1在正常的低磷酸化水平，增加eNOS的磷酸化水平，而VDR拮抗剂增加Caveolin-1的磷酸化，降低eNOS的磷酸化水平，提示VitD可能通过维持Caveolin-1低磷酸化水平，并增加eNOS的磷酸化水平从而促进NO的生成。VitD促进内皮细胞NO生成可能与促进Ca2＋内流、维持Caveolin-1低磷酸化水平从而激活eNOS等有关。
目前，绝大多数有关VtiD防治心血管病的报道是正面的，且有较多的VitD类似物出现，治疗可能较VitD在降低心血管危险、糖尿病肾病等方面更为有效，且不良反应可能更少[14,15]。本结果显示，VitD/VDR复合物可能维持Caveolin-1在低磷酸化水平导致eNOS的磷酸化，可增加内皮NO的生成，对血管功能产生有益的作用。补充VitD或VDR类似物可能是治疗或预防心血管疾病有效药物之一。
