胆道闭锁(biliary atresia，BA)是发生于新生儿的一类具有破坏性及炎症梗阻性的胆道病变，可累及肝内和肝外胆管^[1]。BA是最常见的新生儿期需要外科干预的肝脏疾患，也是小儿肝移植的主要适应证。虽然通过Kasai手术能够改善胆道梗阻，但术后患儿肝脏功能恢复不及预期，约有70%的患儿在成年以前发展至胆汁性肝硬化，最终需要肝移植，目前认为其原因可能与肝内胆管进行性免疫损伤有关^[2,3,4,5]。BA东亚民族高发，文献报道欧美发病率为0.50/万～0.85/万，我国台湾地区高达1.0/万～1.9/万^[6]。BA临床常分为胚胎型和围生期型。胚胎型又称"先天性BA"，临床较少见，常与其他先天异常，如多脾畸形、内脏转位等共存，临床上表现为出生后即有黄疸且持续不退，与胆管发育异常有关，包括胆管板发育异常、基因突变和遗传易感性增强；围生期型又称"获得性BA"，是临床常见的类型，其胚胎发生过程正常，可能由于在围生期遭到病毒等外来刺激诱发胆管损伤所致^[7,8,9,10]。目前研究认为BA的发生可能与遗传因素、病毒感染、免疫损伤、外源性毒素侵袭等多种因素有关^[5,11]，但无论是遗传因素、病毒感染、外源性毒素，最终均会导致胆管上皮的免疫损伤。免疫失调可能是BA发病的中心环节，现将对BA免疫失调近期的研究进展做一综述。

近年来，对于BA发病机制的研究热点开始转向免疫失调及其机制的探讨。目前研究认为由病毒感染而引发胆管上皮自身免疫损伤已成为BA发病原因的主流学说^[12,13,14]。病毒蛋白与胆管上皮细胞蛋白结构相似，产生"分子模拟"现象，引起T淋巴细胞对胆管上皮自身抗原的"交叉反应"，导致胆管炎和胆道闭塞。免疫细胞介导的胆管上皮细胞损伤机制尚不明确，可能是病毒感染或外源性的毒素侵入，导致胆管上皮产生新的抗原或其自身抗原发生改变，这种新的或者改变了的抗原多肽通过与抗原提呈细胞中的人类白细胞抗原(HLA)Ⅱ类分子组成复合体提呈给未分化的辅助T淋巴细胞(Th0)。Th0细胞激活后，取决于微环境中IL-12或IL-4的水平及抗原种类不同，分化为Th1或Th2细胞并分泌一些细胞因子引发一系列的免疫反应：Th2细胞主要分泌IL-4、IL-10和IL-13，刺激B淋巴细胞产生自身抗体；Th1细胞分泌IL-2和干扰素γ(IFN-γ)，刺激产生细胞毒性T淋巴细胞(CTL)，增强HLAⅠ类分子的表达，并诱导胆道上皮细胞上HLA Ⅱ类分子的表达，从而激活巨噬细胞；活化的巨噬细胞又可以释放IL-1和肿瘤坏死因子α(TNF-α)。如果调节性T淋巴细胞不能正常发挥作用，将触发多种效应机制，通过以下几种途径导致胆道上皮的损伤：CTL细胞直接破坏胆道上皮；Th1细胞释放细胞因子引起巨噬细胞聚集；补体系统激活或与Fc受体相关细胞，如自然杀伤(NK)细胞产生的自身抗体在胆道上皮细胞表面结合产生免疫损伤。最近研究还发现当组织生长因子-β(TGF-β)和IL-6增多时，Th17细胞数量增加，其具体机制仍需进一步研究^[9]。在这个过程中，包括固有免疫、细胞免疫、体液免疫、母体微嵌合等多种免疫机制参与其中。表观遗传学是近年研究的热点，在表观遗传学角度对BA免疫失调机制及免疫分子调控机制的研究进展，国内较少报道。

轮状病毒感染后，激活人体固有免疫系统，产生快速非特异性炎性反应，释放大量的致炎因子从而发挥生物学效应，如TNF-α、IL-1、IL-6等。固有免疫主要由免疫屏障、免疫细胞、免疫分子和补体组成。有研究者已经证实，在诊断为BA的患儿肝组织中发现巨噬细胞和库普弗细胞的大量增生。库普弗细胞(CD₆₈⁺)是肝脏中的抗原呈递细胞，在BA的发生中起重要作用。BA患儿汇管区周围巨噬细胞明显浸润且可能与预后不良相关，这与库普弗细胞可释放细胞因子、氧代谢物质和生长因子而激活肝脏星形细胞进而合成分泌胶原导致纤维硬化的作用相吻合。库普弗细胞的另外一个重要作用是分泌与细胞坏死和凋亡相关的TNF、氧代谢物质和一氧化氮。固有免疫细胞由2类受体组成：一类是和细胞膜结合的Toll样受体(TLRs)，一类是和细胞质基质核苷酸结合的寡聚化结构域样受体，二者共同称为模式识别受体^[15]。Saito等^[16]发现BA患儿肝脏较对照组TLR8表达明显上调。BA患儿中接受肝移植组比未接受移植组TLR3和TLR7水平显著升高，更有趣的是这些TLRs均是双链RNA(dsRNA)或者单链RNA(ssRNA)的受体(而这些均是病毒的构件)。Okamura等^[17]发现BA组和慢性丙肝组患者与其他对照组比较，损伤的胆管周围中发现CD₅₆(－)CD₁₆(＋)CD₆₈(－)NK细胞增多。趋化因子X3配体1(CX3CL1)在BA组中高表达，在正常肝脏低表达或者检测阴性。提示CD₅₆(－)CD₁₆(＋)NK细胞可能参与BA胆道损伤的发生。Qiu等^[18]发现NK细胞可能参与轮状病毒诱导的BA小鼠模型中的免疫损伤。

有学者认为参与胆管上皮浸润的淋巴细胞以CD4^＋和CD8^＋T淋巴细胞为主^[9,19]，T淋巴细胞高度激活后分泌成纤维细胞表面活化因子CD₁₇、CD₂₅和淋巴细胞功能相关抗原1(LFA-1)等直接破坏胆管上皮细胞，同时激活其他免疫细胞。此外，T淋巴细胞还分泌Th1细胞因子IFN-γ、IL-2和TNF-α。Bezerra等^[20]利用基因芯片技术在BA患者肝穿刺组织中检测到IFN-γ等促纤维基因。小鼠感染恒河猴轮状病毒(RRV)1周后，汇管区的CD4^＋T淋巴细胞分泌IFN-γ和TNF-α，2周时出现CD8^＋T淋巴细胞和巨噬细胞浸润。IFN-γ是一种重要的免疫调节基因，但是IFN-γ基因敲除小鼠感染RRV后同样会发生胆汁淤积，其中77%的小鼠在3周时胆汁淤积症状好转，野生型小鼠中75%持续恶化。Narayanaswamy等^[21]研究了一系列的细胞因子来筛选BA血清中的生物标志物，包括免疫细胞及其分泌的细胞因子，如Th1(IL-2，IFN-γ)，Th2(IL-4，IL-10)和巨噬细胞(IL-18，TNF-α)以及黏附分子[细胞内黏附分子-1(ICAM-1)和血管细胞黏附分子1]。作者在Kasai手术时和术后6个月分别检测血浆中的各种细胞因子水平，所有的细胞因子(除IL-10外)和黏附分子术后6个月时均增高，提示BA患儿肝门空肠吻合术后存在进行性免疫炎症损伤过程，并没有因为引流手术而缓解。最近也有研究发现BA患儿外周血单个核细胞中，Th17细胞水平明显高于对照组，Treg细胞水平明显低于对照组，还发现IL-17a和IL-23水平也明显升高，其机制也有待于进一步研究^[22]。另外也有多个学者发现其他细胞因子和免疫分子与BA发生相关，如IL-4^[23]、IL-18^[24]、IL-12p40^[25]、CK7^[26]、Ki67^[26]、CD₃₄^[26]、CD₅₆^[27]等。Guo等^[28]发现导致实验性BA小鼠胆道上皮损伤是CD8^＋T淋巴细胞和NK细胞的联合作用。HLA是一种重要的调节T淋巴细胞免疫应答的抗原，可参与多种免疫反应。Mack等^[29]共同研究了180例BA患者和360例同种族的对照组，分析他们的HLA及其等位基因，包括HLA-A，－B，－C，－DRB1，－DPB1，－DQB1，结果没有发现任何一种HLA或其等位基因与BA相关。Dong等^[30]发现BA组患儿血清IL-33水平较无黄疸的胆总管囊肿组患儿和健康对照组儿童明显升高，而且IL-33水平的升高程度与γ-谷氨酰转肽酶(γ-GT)水平呈相关性。此外在肝活检标本中IL-33 mRNA与蛋白水平也较对照组升高。这些发现提示IL-33过表达可能在BA炎症损伤中发挥重要作用。Shivakumar等^[31]研究发现穿孔素和端粒酶可以进一步加重NK细胞和CD8^＋T淋巴细胞介导的上皮损伤，因此抑制这些颗粒对于阻止实验性BA发生有重要作用。

很多自身免疫性疾病的动物模型中已经证实B淋巴细胞参与疾病发生，但目前B淋巴细胞和体液免疫在BA中的研究报道相对较少^[32]。体液免疫是由B淋巴细胞特异性识别抗原，激活并分泌抗体来发挥生物学效应。首先引起B淋巴细胞的活化和克隆增殖，在效应阶段，通过分泌抗体来吞噬抗原。婴儿出生时几乎IgG均来自于母体，出生后3～6周，IgG呈指数式下降，并且在1.5～3.0个月降至最低点。这个时间点也正是新生儿开始合成IgG的时候，直到5岁左右达到成人水平^[33]。在RRV诱导的BA小鼠模型的体液免疫研究中，肝内胆管周围存在IgG沉积^[34]；经免疫印迹证实，其血清抗体可与胆管上皮匀浆的多种蛋白反应，提示存在胆管上皮特异性自身抗体可能。Mack等^[34]在体液免疫的研究中发现RRV诱导的BA小鼠的肝内胆管周围有免疫球蛋白沉积，并通过Western bolt检测发现针对胆管上皮细胞来源的多种抗体，推测可能有针对胆管上皮的自身抗体的存在。他们的研究小组在后来的研究中还发现BA小鼠模型血清中存在针对胆管上皮细胞的抗体，并通过质谱分析发现与抗体发生特异性反应的胆管上皮细胞抗原为α-enolase。通过enolase和病毒蛋白抗体的交叉实验以及enolase与轮状病毒编码的蛋白具有相似的氨基酸序列推测分子模拟现象可能是其抗体产生的原因^[35]。Feldman等^[36]最近研究发现，野生型和B淋巴细胞(Ig-α－/－)缺陷小鼠2组出生后均给予腹腔注射轮状病毒，Ig-α－/－组小鼠无病生存率显著高于野生型组(76.8%比17.5%)，提示B细胞介导的体液免疫反应在BA中扮演重要角色。研究还证实Ig-α－/－组小鼠未发生高胆红素血症或胆道梗阻，肝脏炎症和Th1细胞的表达均显著低于野生型组。此外，Ig-α－/－组小鼠在轮状病毒注射前后Treg细胞的数量均较野生型组显著增加，然而随着Treg细胞的消耗减少，Ig-α－/－组小鼠也未发生胆道梗阻，暗示大量存在的Treg细胞并非Ig-α－/－组小鼠未发生胆道梗阻的唯一保护因素。

机体内含有少量其他个体来源的细胞或DNA成分称为微嵌合体，胎源性细胞或DNA成分在母体妊娠过后仍长期存在于母体血循环中，呈现微嵌合体现象。目前认为这些微嵌合体可能导致某些疾病的发生。有学者在BA中检测到母体微嵌合状态的存在，提示由此导致的免疫反应可能参与BA的发生。另外的一项研究则发现在BA的肝细胞中，存在着大量的母体嵌合的CD8^＋T淋巴细胞，进一步提示母体的免疫损伤可能在BA的发病中起重要作用^[37,38]。因此，BA患儿可能存在类似于移植物抗宿主反应的同种免疫反应。Nijagal等^[39]通过同种异体的免疫耐受得到启示，提出母体微嵌合体可能参与BA的发生。他们研究了BA患儿接受亲体肝移植后移植失败的病例，研究发现母体微嵌合体明显升高。同时他们还发现，接受母亲供肝的患儿与接受父亲供肝的患儿相比较，移植失败率和再移植率明显降低。更有意思的是，没有BA的受赠者无论是母体还是父体供肝，移植结局都是一样的，由此表明，母体微嵌合导致的免疫耐受可能是BA发病的内在原因。Muraji等^[40]提出一种母体微嵌合的二次打击学说，作者推测第一次打击可能是由于分娩后母体来源的效应T淋巴细胞产生移植物抗宿主反应，第二次打击则归因于母体嵌合的效应T淋巴细胞(如移植物抗宿主反应)或者是靶细胞(如宿主抗移植物反应)，进一步导致进展性的肝硬化。

DNA甲基化是DNA最常见化学修饰的一种形式，能在不改变DNA序列的前提下，改变遗传的现象。目前认为其可能参与调控多种生物学过程，包括基因转录、X染色体的活化、基因印记和染色体的修饰。药物、毒物、病毒感染以及基因缺陷均可能诱发DNA甲基化的发生^[14]。基于对已有研究的总结，Matthews等^[41]提出了一个假设，DNA甲基化可能参与BA的发生过程。因此，一个新的BA的模型——斑马鱼模型产生，用来证明此假设是否成立。他的研究小组利用斑马鱼模型证明通过基因或药物抑制DNA甲基化，可以导致肝内胆管缺陷和肝脏表达IFN-γ途径基因上调。同时通过抑制DNA甲基化导致的胆道缺陷可以通过糖皮质激素治疗来逆转，提示炎症激活可能起着关键作用。BA患儿胆管细胞DNA甲基化数量比其他胆汁瘀积症的患儿要低。提示DNA甲基化的抑制、IFN-γ信号通路的激活及BA之间可能存在一定的因果联系。同时发现，在人类BA患者的肝组织中DNA甲基化水平较正常肝组织低，进一步支持DNA低甲基化可能与BA发病有关。Dong等^[42]研究BA患者IFN-γ介导的CD4^＋T淋巴细胞甲基化改变，发现BA患者中某些基因是呈低甲基化的。他们发现BA患者CD4^＋T淋巴细胞中DNA甲基转移酶1、DNA甲基转移酶3a和甲基化DNA结合域蛋白1基因的mRNA呈低表达。基于上述研究，IFN-γ可能在胆管损伤中发挥重要作用。同时他们提出是否因为DNA低甲基化而导致IFN-γ通路变化。结果发现在BA患者中，IFN-γ的mRNA表达水平显著升高。更重要的是，BA患者CD4^＋T淋巴细胞中IFN-γ基因启动子区称低甲基化状态，从而导致了IFN-γ的表达不受调控。因此，作者得出如下结论：CD4^＋T淋巴细胞的甲基化改变可能通过影响炎症和自身免疫相关的基因的表达，最终导致BA患者的胆管损伤。

总之，BA的病因及发病机制仍不明确，但不论何种因素，可能都有一些免疫机制参与其中。BA最主要的病变是肝门区纤维块形成以及肝脏进行性纤维化，推测可能是某种因素(病毒感染、遗传缺陷、母体源性外源性物质等)诱发了针对胆道上皮细胞抗原的自身免疫损伤，在此过程中有多种免疫细胞和细胞因子参与，他们之间相互作用，导致肝内小胆管及肝外胆道持续性的免疫损伤造，最终导致肝纤维化及胆道梗阻。今后的研究将致力于解决这些免疫细胞及细胞因子受何调控以及如何发挥作用，如何阻断进行性的免疫损伤将是改善BA患儿预后的关键。