艰难梭菌是一种专性厌氧的革兰阳性芽孢杆菌，是抗生素相关性腹泻最常见的一种致病菌，可引起艰难梭菌相关性腹泻。近年来随着广谱抗生素的大量使用，菌株耐药性的增加，高毒力菌株的出现，艰难梭菌感染在全球的发生率明显上升。现就艰难梭菌相关性腹泻的研究进展作一简要综述。
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艰难梭菌(Clostridium difficile，C.d)又称难辨梭状芽孢杆菌，是一种存在于人体肠道内的专性厌氧的革兰阳性芽孢杆菌，属条件致病菌，是引起抗生素相关性腹泻(AAD)最常见的一种病因，研究表明，10%～20%的AAD和几乎所有的伪膜性肠炎均与C.d有关[1]。当肠道环境遭到破坏，定植于人体肠道内或经口摄入的产毒性C.d大量繁殖并释放毒素，可引起C.d感染(CDI)和C.d相关性腹泻(CDAD)，严重者发展为伪膜性肠炎。近些年随着抗生素的广泛应用，CDAD在成人及儿童中发病率不断增高，引起了医务工作者的高度关注。
C．d最早于1935年由Hall和O'Toole从健康新生儿粪便中分离[2]，广泛分布于自然环境及动物和人的粪便中，以繁殖体或芽孢的形式存在。C.d可分为非产毒菌株和产毒菌株，非产毒菌株不产生毒素，无致病性。产毒菌株能产生6种毒素，主要致病毒素为毒素A、毒素B、二元毒素。
C．d产毒菌株主要通过分泌毒素A和毒素B 2种外毒素致病。毒素A为相对分子质量308 000的肠毒素，主要通过与肠黏膜刷状缘细胞上毒素受体结合，改变细胞肌动蛋白骨架，介导黏膜上皮细胞的环磷酸腺苷(cAMP)系统，使水和盐分泌增加导致分泌性腹泻，甚至引起黏膜出血，也有一定的细胞毒性作用，但毒力小于毒素B[3]。毒素B为相对分子质量270 000的细胞毒素，其细胞毒性是毒素A的1 000倍[4]，可直接损伤肠壁细胞，引起炎性反应，造成肠壁细胞凋亡、变性、坏死和脱落，纤维素、黏蛋白渗出形成伪膜，引起渗出性腹泻[5]。通常C.d同时携带2种毒素，但尚有一部分菌株只产生毒素B。20世纪90年代早期，CdA–B＋菌株被首次报道，近年来关于A–B＋菌株的报道逐渐增多，打破了以往认为毒素B仅在毒素A损伤肠黏膜细胞基础上才能致病的观点，提示毒素B可单独直接致病[6]。
除毒素A和毒素B外，少数变异菌株还可以产生二元毒素[7]。二元毒素是一种肌动蛋白特定的二磷酸腺苷(ADP)-核糖基转移酶。其由2部分组成：CDTa(enzyma-tic component)和CDTb(binding component)[8]。CDTb可与细胞受体结合，促使CDTa进入细胞，CDTa可阻断肌动蛋白片段的合成而诱导细胞死亡[9]。二元毒素可导致细胞骨架破坏，增强毒素A和毒素B的作用导致严重病变，是否能单独致病尚不明确。二元毒素阳性的菌株绝大多数都产生毒素A和毒素B，但有2%的菌株只产生二元毒素，而不产生毒素A和毒素B。
与传统菌株相比，还有一种高毒力致病菌株，其所致疾病更为严重，目前常见的高产毒菌株为核糖体分型027型和078型。自2002年，致欧洲和北美C.d感染率升高的高产毒菌株主要为027/NAP1BI型(核酸分型为027，脉冲场凝胶电泳分型为NAP1，限制性内切酶分型为BI)，其致病位点的tcdC基因存在移码突变，产生的毒素A和毒素B分别是传统毒株的16倍和23倍，而且可以产生二元毒素，使CDAD的复发率和病死率明显上升[10]。Cheng等[11]于2008年9月1日至12月31日收集我国香港723份粪便样本进行C.d毒素检测，共检测出37例阳性样本(5.1%)，并发现其中有12株为027型，这是国内最早的关于027感染的报道。2005年，荷兰发现了一种高毒力致病菌株078核糖型(PCR ribotype 078，toxin type V)[12]，078型菌株二元毒素阳性，在tcdC基因中含一个39 bp的缺失[13]，并且多数含有抗生素(四环素)的耐药基因[14]，所造成的疾病严重性同027型，在体外产生的毒素A和毒素B的水平较027型低，但高于普通菌株[15]。
C．d属条件致病菌，产毒株与非产毒株在一定条件下都可以在肠道内定植(无症状携带)，但宿主无腹泻等相应的临床症状[16]。健康成人粪便中C.d的阳性率约为3%，而住院患者的携带率为15%～35%[17]。儿童的C.d携带率较成人高，2岁以下婴幼儿的定植率可达60%甚至更高[18]。Rousseau等[19]报道3岁以下无症状婴幼儿C.d携带率为45%，2～6个月、7～9个月、10～12个月、12～24个月和24～36个月的婴幼儿C.d携带率分别为36%、67%、75%、41%和6%；其中产毒株为13%，以上对应的年龄组携带产毒菌株分别为18%、13%、19%、11%和6%。Rousseau等[20]对10个健康婴儿从出生到1岁进行了1年的随访研究，每月取粪便，共收集了111份粪样标本，采用PCR方法进行C.d检测及其毒素基因分型。结果显示C.d检出率为73%(81/111例)，其中产毒株占26%(21/81例)，3例婴儿是在出生1个月内检出的，其余是在4～6个月检出的；C.d的定植绝大多数呈持续状态，最长的为持续9个月；4例婴儿为无症状产毒菌株携带者，其中3例婴儿持续携带了4～9个月。
婴幼儿C.d定植率高与肠道内益生菌的竞争性抑制、母体获得的保护性抗体、自身免疫系统发育不成熟，缺乏毒素A受体等因素有关。Rousseau等[21]发现有C.d定植的婴儿肠道内除双歧杆菌的数量减少外，还会出现大量的瘤胃球菌和肺炎克雷伯菌，提示双歧杆菌可抑制C.d在肠道内的定植，而兼性厌氧菌的增加有利于C.d的定植。Sjögren等[22]发现，婴幼儿肠道内双歧杆菌的数量与唾液中分泌型IgA的水平呈明显相关性，CDI患者活检标本中产IgA的细胞明显减少，而在伪膜性肠炎患者中这种细胞降到最低水平。
虽然儿童对C.d有很高的携带率，但近年来儿童CDI的流行病学发生了很大改变，发病率和严重程度均显著增加。Kim等[23]对美国22所儿童医院的住院患者进行CDAD监测，发现2001年至2006年，CDAD年发病率从2.6‰增长到4.0‰，平均年龄4岁，26%的患者年龄<1岁，新生儿发病率高达5%，1～17岁的CDI患者还在不断增加。Khanna等[24]对1991年至2009年住院的儿童进行了基于人群的CDI调查，结果显示确定CDI患儿92例，平均年龄2.3岁(1个月～17.6岁)。进行年龄、性别校正后，CDI的发生率为13.8/100 000，增加了12.5倍，从1991年至1997年的2.6/100 000上升到2004年至2009年的32.6/100 000 (P<0.000 1)。重症CDI、有合并症的以及复发的CDI发生率分别为9%、3%和20%。高产毒株027/NAP1/BI型在成人引起严重腹泻甚至死亡，在儿童中同样能引起严重的疾病。Toltzis等[25]在2家儿童医院筛查是否存在高产毒株时发现，195例患者中有19%为高产毒株感染，平均年龄2.5岁，5例患者<1岁。2004年，美国疾病预防控制中心报道CDAD的病死率由1999年的5.7/1 000 000增长到2004年的23.7/1 000 000。2003年加拿大C.d感染率较以前增长了3倍多，且病死率高达6.9%[26]。儿童社区获得性CDAD也呈上升趋势，Benson等[27]研究表明，2001年至2006年，儿童社区获得性CDAD的发病率从1.18‰增长到2.47‰。Khanna等[24]报道社区CDI的发病率为10.3/100 000，增加了10.5倍，从1991年至1997年的2.2/100 000上升到2004年至2009年的23.4/100 000 (P<0.000 1)。我国目前尚缺乏CDAD的大规模流行病学资料，多为散发病例。郭姝等[28]对2010年至2011年北京儿童医院95例AAD患儿进行毒素基因检测，检测出35例为CDAD。冯云等[29]对上海复旦大学附属儿童医院111例腹泻患儿的粪便标本进行C.d毒素检测及粪便标本直接培养，检测出16例(14.41%)为CDAD，其中5例为新生儿(包括2例低出生体质量早产儿)。
目前认为CDI涉及的危险因素主要分为3个方面：肠道菌群紊乱、患者因素、医疗原因。
Ferroni等[30]认为，儿童CDAD可发生于首次应用抗生素的4～18 d，且林可霉素与儿童CDAD有关。常见的与儿童CDAD相关的抗生素见表1[31]。Wultańska等[32]对50株从儿童粪便分离出的C.d进行了耐药性分析，其中26%的菌株对红霉素和克林霉素耐药，对环丙沙星、莫西沙星、加替沙星和亚胺培南的耐药率分别为98%、8%、8%和30%。
与艰难梭菌相关腹泻相关的抗生素
Antibiotics associated with Clostridium difficile–associated diarrhea
与艰难梭菌相关腹泻相关的抗生素
Antibiotics associated with Clostridium difficile–associated diarrhea
| 高危 | 中危 | 低危 |
|---|---|---|
| 二代和三代头孢菌素 | 喹诺酮类 | 氨基糖苷类 |
| 克林霉素 | 磺胺类 | 甲硝唑 |
| 林可霉素 | 大环内酯类 | 枯草杆菌肽 |
| 氨苄西林/阿莫西林 | 四环素类 | 万古霉素 |
| 甲氧苄啶 | ||
| 氯霉素 |
患者因素包括年龄、喂养方式、肠道黏蛋白层的厚度及组成、免疫反应和基础疾病。近20年，许多文献报道6个月～2岁似乎是发生CDAD的高峰时期，这可能与肠道正常厌氧菌群的建立发生于出生后的第2年有关[31]。Tullus等[33]研究发现，6个月大时，人工喂养婴儿的C.d定植率为39%，明显高于母乳喂养的19%，C.d阳性人工喂养的儿童有27%发生了腹泻。肠道黏蛋白的厚度及组成与无症状的婴儿C.d携带者有关，黏蛋白层可保护肠黏膜不受C.d的损害，一些致命性的儿童CDAD与黏膜黏蛋白层的改变有关[34]。Gryboski等[35]研究显示，复发CDI患儿的丙种球蛋白较未复发患儿低。在43例患儿中，血清IgA水平降低为35%，血清IgG水平降低为26%。CDI危险因素涉及的基础疾病包括肿瘤、器官移植、炎症性肠病(IBD)等。Tai等[36]发现患有肿瘤的儿童患CDI的概率是无肿瘤儿童的15倍，并且在儿童CDI病例中，肿瘤患者占21%。Chavers等[37]对164例肾移植患儿的研究表明，5岁以下儿童最普遍感染的细菌为C.d，并且术后随访6个月，CDI仍然以5岁以下儿童最多见。Wultańska等[38]对58例波兰儿童IBD研究显示，感染C.d的风险为60%，并且IBD为独立危险因素(χ2＝2.582 1，P＝0.460 6)，CDI复发率为17%。Pascarella等[39]发现IBD患者中CDI的患病率明显高于非IBD患者(χ2＝0.003，P＝0.004，OR＝3.3，95% CI 1.5～7.6)。且在IBD患者中，感染C.d患者的疾病活动程度明显高于未感染C.d的患者。
目前有一些医疗操作及非抗生素类药物的使用，如胃肠道手术或操作、机械通气、透析、肠内营养及应用抑酸药物等可增高CDAD发生的风险。Turco等[40]研究表明，与未感染C.d组比较，质子泵抑制剂(PPI)的应用使患CDAD风险增高(OR＝4.5，95%CI 1.4～14.4)。Sandora等[41]研究发现胃造瘘术或空肠造瘘术(胃管或空肠喂养管的应用)为危险因素(OR＝3.32，95% CI 1.71～6.42)。郭姝等[28]研究显示白细胞计数(OR＝8.063，P＝0.003)、C反应蛋白(CRP)(OR＝3.465，P＝0.008)、应用非甾体抗炎药(OR＝13.950，P＝0.015)为危险因素；入院前医疗机构接触史(OR＝0.002，P<0.01)为保护因素。
此外，随着近些年来社区获得性CDAD的增多，CDAD的流行病学也发生了改变，越来越多的CDAD患者为一些年轻、无医疗机构接触史、无抗生素应用史的"低危人群"[42]。
随着对CDI的逐步认识，对C.d诊断的方法的研究也逐步开展。目前国内外对C.d及其毒素的诊断研究较多，选择性检测方法也发展很快，主要集中在厌氧培养、组织细胞培养细胞毒试验、酶联免疫法、PCR等几个方面。
目前，C.d的分离培养通常用CCFA选择培养基，需要严格的厌氧环境，花费时间较长，需3～4 d才能得到结果，会延长诊治时间[43]。但对重症CDI及复发病例，需要依据抗生素的敏感性选择药物时，仍需进行厌氧培养。此外细菌培养不能确定C.d是否产生毒素，要确定是否为产毒菌株，需要进一步行细菌毒素测定。采用细胞培养技术进行细胞毒试验可以确定菌株是否产毒素，敏感性和特异性均很高，被作为本病实验室诊断的金标准，但细胞培养分析技术较复杂，且要24～48 h才能出结果，临床应用受到一定的限制。酶联荧光免疫法检测毒素A和毒素B，该方法出现较早，操作简单，省时省力，且灵敏度、特异性均较高，是目前许多实验室的首选方法。PCR方法用来检测C.d的毒素基因，该方法快速、灵敏，对C.d基因谱研究、流行病学研究有重要意义，但与传统方法相比，敏感性极高、特异性稍低，目前仅适用于科研而不适合临床应用。在培养的基础上采用PCR法检测C.d毒素，操作比较繁琐，所需时间长，有学者对此进行了改进，采用多重PCR方法，一步即可检测3种毒素，快速、特异[44]；之后又有学者改进了一种更加方便的方法，采用Real-time PCR直接从粪便标本中检测毒素基因[45]，该方法敏感性、特异性均好，但实验要求较高。此外，C.d在繁殖过程中会产生谷氨酸脱氢酶(GDH)，ELISA方法对患者粪便GDH的检测能够精确地判断粪便样品中是否存在C.d，且实验较为简单、快速，适用于临床。Sharp等[46]报道其灵敏度为100.0%，特异性为99.6%。但该方法不能确定C.d是否产毒素。
2013年美国颁布了CDI的诊断、治疗、预防指南[47]，2014年欧洲临床微生物和感染病学会(ESCMID)更新了CDI治疗指南[48]，并对抗生素、毒素-结合树脂和聚合物、免疫疗法、益生菌、粪菌及肠道细菌移植等各种治疗方法进行了综述。指南对CDI进行了分级，分为轻度到中度、严重CDI、复杂CDI及CDI复发，并针对不同级别制定了治疗方案，见表2。儿童CDI甲硝唑使用剂量为10 mg/(kg·次)，3次/d，万古霉素为2.5～10.0 mg/(kg·次)，4次/d。
艰难梭菌感染的治疗
Treatment of Clostridium difficile infection
艰难梭菌感染的治疗
Treatment of Clostridium difficile infection
| 分级 | 标准 | 治疗 | |
|---|---|---|---|
| 轻度到中度 | 腹泻 | 甲硝唑500 mg，口服，3次/d，共10 d；如患者不耐受，万古霉素125 mg，口服，4次/d，共10 d | |
| 严重CDI | 血清清蛋白<30 g/L合并WBC≥ 15×109/L或腹部压痛 | 万古霉素125 mg，口服，4次/d(可增加到500 mg，4次/d)，共10 d；或非达霉素200 mg，2次/d，共10 d | |
| 复杂CDI | CDI出现以下任一种情况： | 万古霉素500 mg，口服，4次/d，甲硝唑500 mg，每8 h静脉注射1次，并用万古霉素500 mg加500 mL 9 g/L盐水灌肠 | |
| 因CDI入ICU | |||
| 低血压无论需不需要用升压药 | |||
| 发热≥ 38.5 ℃ | |||
| 肠梗阻或明显腹胀 | |||
| 精神状态改变 | |||
| WBC≥ 35×109/L或<2×109/L | |||
| 血清乳酸>2.2 mmol/L | |||
| 终末器官衰竭 | |||
| CDI复发 | 治疗8周内复杂CDI复发 | 重复甲硝唑、万古霉素治疗方案 | |
注：CDI：艰难梭菌感染；ICU：重症监护病房 CDI：Clostridium difficile infection；ICU：intensive care unit
非达霉素(fidaxomicin，Dificid)在治疗CDAD上有显著疗效，且复发率低，可用于全部适用于口服抗生素治疗的CDI患者。应用非达霉素特定的适应证包括CDI初次复发或有复发风险、多次复发及有严重疾病或轻症CDI患者，非达霉素可作为一线治疗药物。
对于多次复发的CDI，指南强烈推荐使用粪菌移植。
对于CDI伴有结肠穿孔和/或全身炎症及经过抗生素治疗但恶化的患者推荐进行全结肠切除术或回肠造口联合结肠灌洗。
面对国内外CDI的新特点和流行趋势，应该充分认识到对CDI的控制重点在于预防而不是治疗。预防CDI发生的根本措施是合理应用抗生素，严格控制广谱抗生素的滥用。用药要有明确的适应证，必须使用抗生素时，首先选用窄谱抗生素，或选用不易引起CDI的抗生素，如胃肠外给药的氨基糖苷类药物、磺胺类药物、大环内酯类药物、万古霉素，以避免肠道菌群失调。及时开展C.d检测方法，对可疑患者要及时诊断、避免漏诊，若患者确诊为CDI，应该实施隔离，并对环境特别是患儿的粪便进行消毒处理，同时对病例进行积极跟踪和监督。医务人员在接触患儿后必须用肥皂和流水洗手。研究显示，益生菌在高危人群中，对预防AAD和CDAD有效[49,50]。
