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黄芩苷对肠上皮细胞缺氧复氧损伤后屏障功能的影响
中华实用儿科临床杂志, 2015,30(7) : 494-497. DOI: 10.3760/cma.j.issn.2095-428X.2015.07.004
摘要
目的

探讨黄芩苷对肠上皮细胞缺氧复氧损伤后屏障功能的影响。

方法

建立大鼠小肠上皮细胞(IEC-6)缺氧复氧损伤模型。采用3-(4，5-二甲基-2-噻唑基)-2，5-二苯基四氮唑嗅盐(MTT)比色法检测细胞增殖，筛选黄芩苷浓度。设立对照组，缺氧复氧组，缺氧复氧＋5.0×10–3 mol/L黄芩苷组，缺氧复氧＋1.0×10–3 mol/L黄芩苷组，缺氧复氧＋0.2×10–3 mol/L黄芩苷组；采用紫外线分光光度计检测细胞上清中丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)水平；Western blot方法检测细胞紧密连接蛋白Occludin和Zonula Occludens 1(ZO-1)的表达及核因子-κB(NF-κB)蛋白表达水平；实时荧光定量-PCR法检测Occludin和ZO-1 mRNA表达水平。

结果

MTT比色法显示黄芩苷可缓解缺氧复氧对细胞增殖的抑制(对照组吸光度值：0.442±0.015，缺氧复氧组：0.256±0.007，缺氧复氧＋5.0×10–3 mol/L黄芩苷组：0.407±0.008；F＝66.904，P<0.05)。缺氧复氧组较对照组细胞上清中MDA水平增加[对照组：(3.502±0.231) mol/L，缺氧复氧组：(5.541±0.143) mol/L]，SOD水平减少[对照组：(20.073±0.493)×103 U/L，缺氧复氧组：(13.324±0.081)×103 U/L]，Occludin和ZO-1的蛋白、mRNA表达量减少，NF-κB(P65)蛋白表达量增加(P均<0.05)。与缺氧复氧组相比，黄芩苷各组随黄芩苷水平升高，细胞上清中MDA水平逐渐减少[缺氧复氧＋5.0×10–3 mol/L黄芩苷组：(4.320±0.106) mol/L，缺氧复氧＋1.0×10–3 mol/L黄芩苷组：(4.578±0.080) mol/L，缺氧复氧＋0.2×10–3 mol/L黄芩苷组：(4.928±0.118)mol/L]，SOD水平增加[缺氧复氧＋5.0×10–3 mol/L黄芩苷组：(18.462±0.284)×103 U/L，缺氧复氧＋1.0×10–3 mol/L黄芩苷组：(16.624±0.364)×103 U/L，缺氧复氧＋0.2×10–3 mol/L黄芩苷组：(14.023±0.140)×103 U/L]，Occludin和ZO-1的蛋白、mRNA表达量增加，NF-κB(p65)蛋白表达量减少(P均<0.05)。

结论

黄芩苷可通过降低NF-κB的活性减轻缺氧复氧对肠上皮细胞屏障的损伤。

引用本文: 任翔, 傅廷亮, 马明明, 等.  黄芩苷对肠上皮细胞缺氧复氧损伤后屏障功能的影响 [J] . 中华实用儿科临床杂志, 2015, 30(7) : 494-497. DOI: 10.3760/cma.j.issn.2095-428X.2015.07.004.
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肠黏膜屏障作为一种代谢屏障，其功能是防止有害物质渗透性增加，防止病原体、毒素和细菌等进入黏膜组织及循环系统[1,2,3,4]，肠道正常功能依赖于肠黏膜屏障的建立和维护[5]。紧密连接蛋白在肠黏膜屏障中起重要作用[6]，而紧密连接蛋白又主要由Occludin[7]、Claudins[8]和Zonula Occludens 1(ZO-1)[9]构成。紧密连接蛋白损伤会造成肠上皮功能障碍，从而使病原体渗透性增加，毒素和细菌进入体内，导致炎性反应和组织损伤。黄芩苷是一种黄酮类物质，具有抗感染、抗氧化和抑菌等作用，在中药配方及实验中得到应用[10]。研究表明黄芩苷可减轻脑[11]、肾[12]和心肌细胞的[13,14,15]缺血再灌注损伤，但尚未见黄芩苷对肠缺血再灌注损伤影响的研究报道。本研究探讨黄芩苷对肠上皮细胞缺氧复氧损伤后屏障功能的影响。

1　材料与方法
1.1　材料

大鼠小肠上皮细胞(IEC-6)购自中国科学院细胞库，Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM)高糖培养基、胎牛血清购自美国HyClone公司，黄芩苷购自南京泽朗生物有限公司，丙二醛(MAD)和超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒、凝胶配置试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司，大鼠Occludin、ZO-1抗体购自美国abcam公司，核转录因子(NF)-κB(P65)抗体购自美国Sigma公司，GAPDH内参抗体、辣根过氧化物酶标记二抗购自杭州中彬生物技术公司；Trizol及实时荧光定量(RT)-PCR相关试剂盒购自大连宝生生物工程有限公司。

1.2　方法
1.2.1　细胞培养

细胞接种于250 mL的培养瓶中，加入完全培养基(含100 mL/L胎牛血清和100 U/L胰岛素的DMEM高糖培养基)培养，置37 ℃、湿度95%、含50 mL/L二氧化碳(CO2)的培养箱中，1～2 d更换培养液，细胞生长至90%融合时消化并传代。

1.2.2　细胞缺氧复氧模型制备

正常培养的细胞，移去培养基，加入原体积20%的新鲜细胞培养基；置缺氧培养箱中，充入混合气体(850 mL/L氮、100 mL/L氢和50 mL/L CO2) 4 min，测得容器内气体氧体积分数<10 mL/L，培养2 h后置入常规培养箱中复氧1 h。加入新鲜培养基和黄芩苷溶液，置常规培养箱24 h。

1.2.3　3-(4，5-二甲基-2-噻唑基)-2，5-二苯基四氮唑嗅盐(MTT)比色法检测细胞增殖

将细胞密度为2×108/L的200 μL完全培养基置96孔板中，简单随机法分成对照组、缺氧复氧组、缺氧复氧＋10.0×10–3 mol/L黄芩苷组、缺氧复氧＋5.0×10–3 mol/L黄芩苷组、缺氧复氧＋1.0×10–3 mol/L黄芩苷组、缺氧复氧＋0.5×10–3 mol/L黄芩苷组、缺氧复氧＋0.2×10–3 mol/L黄芩苷组、缺氧复氧＋0.1×10–3 mol/L黄芩苷组。待细胞贴壁后，建立缺氧复氧模型，完成后更换含黄芩苷的完全培养基，96孔板置常规培养箱中继续培养24 h，移去原培养基，每孔加入终质量浓度为250 mg/L的MTT溶液继续培养4 h，吸去孔内溶液，每孔加入150 μL二甲基亚砜，室温下置摇床上低速振荡10 min使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪波长490 nm处测量各孔的吸光度值。

1.2.4　MDA和SOD水平检测

完成缺氧复氧模型建立后，收集细胞上清，根据试剂盒说明书完成MDA和SOD水平测定。

1.2.5　Western blot

将细胞接种于6孔板内，当细胞达到60%融合时，行缺氧复氧模型的建立，提取细胞蛋白，每组样本取蛋白30 μg，95 ℃煮样10 min，行凝胶电泳，电泳后将蛋白转至硝酸纤维素膜上，脱脂奶粉封闭2 h，加入目的蛋白抗体4 ℃过夜，加入辣根过氧化物酶标记二抗室温2 h，采用免疫印迹试剂检测信号。

1.2.6　RT-PCR

将细胞接种于6孔板内，当细胞达到60%融合时，行缺氧复氧模型的建立，每孔加入1 mL Trizol，按照试剂说明书提取细胞总RNA。测量总RNA水平，采用PremeScript RT Reagent Kit完成反转录。RT-PCR检测目的mRNA，目的基因的表达以GAPDH为内参进行标准化。Occludin上游引物：5'-CACACTTGCTTGGGACAGAG-3'，下游引物：5'-TAGCCGTAACCGTAGCCGTA-3'；ZO-1上游引物：5'-ACCCGAAACTGATGCTATGG-3'，下游引物：5'-GTTGGACAGAGGCGGAACT-3'；GAPDH上游引物：5'-GTGCCAGCCTCGTCTCATAG-3'，下游引物：5'-CTTTGTCACAAGAGAAGGCAG-3'。PCR反应使用SYBR Premix Ex Taq Kit体系并按照说明书进行。

1.3　统计学处理

采用SPSS 17.0软件进行分析，结果用±s表示，组间数据比较采用方差分析，方差不齐用Dunnetts检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2　结果
2.1　黄芩苷缓解缺氧复氧对细胞增殖的抑制

缺氧复氧组细胞数量(吸光度值：0.256±0.007)明显少于对照组(0.442±0.015)(F＝66.904，P<0.05)；缺氧复氧＋10.0×10–3 mol/L黄芩苷组与缺氧复氧＋5.0×10–3 mol/L黄芩苷组细胞数量比较差异无统计学意义(0.408±0.612比0.407±0.008，P＝0.956)；缺氧复氧＋0.2×10–3 mol/L黄芩苷组与缺氧复氧＋0.1×10–3 mol/L黄芩苷组细胞数量比较差异无统计学意义(0.261±0.008比0.256±0.015，P＝0.768)；缺氧复氧＋0.2×10–3 mol/L黄芩苷组、缺氧复氧＋1.0×10–3 mol/L黄芩苷组(0.376±0.014)和缺氧复氧＋5.0×10–3 mol/L黄芩苷溶液组中随黄芩苷的浓度增加，细胞数量也增加(F＝66.904，P<0.05)。设立对照组，缺氧复氧组，缺氧复氧＋5.0×10–3 mol/L黄芩苷组，缺氧复氧＋1.0×10–3 mol/L黄芩苷组，缺氧复氧＋0.2×10–3 mol/L黄芩苷溶液组行后续实验。

2.2　MDA和SOD水平检测结果

缺氧复氧组细胞上清中MDA水平明显高于对照组；黄芩苷组随黄芩苷浓度增加，MDA水平降低(F＝110.796，P<0.05)；缺氧复氧组细胞上清SOD水平明显低于对照组，黄芩苷组随黄芩苷浓度增加，SOD水平升高(F＝255.56，P<0.05)，见表1。

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表1

大鼠小肠上皮细胞上清中MDA及SOD水平(±s)

Table 1

MDA and SOD levels of on intestinal epithelial cell culture medium(±s)

表1

大鼠小肠上皮细胞上清中MDA及SOD水平(±s)

Table 1

MDA and SOD levels of on intestinal epithelial cell culture medium(±s)

组别MDA水平(mol/L)SOD水平(103 U/L)
对照组3.502±0.23120.073±0.493
缺氧复氧组5.541±0.14313.324±0.081
缺氧复氧＋5.0×10–3 mol/L黄芩苷组4.320±0.10618.462±0.284
缺氧复氧＋1.0×10–3 mol/L黄芩苷组4.578±0.08016.624±0.364
缺氧复氧＋0.2×10–3 mol/L黄芩苷组4.928±0.11814.023±0.140

注：MDA：丙二醛；SOD：超氧化物歧化酶　MDA：malondialdehyde；SOD：supero-xide dismutase

2.3　Occludin、ZO-1和NF-κB(P65)的蛋白表达

缺氧复氧组细胞膜上Occludin和ZO-1的蛋白表达量明显低于对照组，黄芩苷组随黄芩苷浓度增加，Occludin和ZO-1的表达量升高(F＝277.205、1 292.868，P均<0.05)；缺氧复氧组细胞核内NF-κB(P65)蛋白表达量明显高于对照组，黄芩苷组随黄芩苷浓度增加，NF-κB(P65)表达量降低(F＝533，P<0.05)，见图1。

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图1
Occludin、ZO-1和NF-κB(P65)的蛋白表达
Figure 1
Expressions of Occludin，ZO–1 and NF–κB(P65)protein
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注：ZO-1：Zonula Occludens 1；NF-κB(P65)：核转录因子-κB(P65)；1：对照组；2：缺氧复氧组；3：缺氧复氧＋5.0×10–3 mol/L黄芩苷组；4：缺氧复氧＋1.0×10–3 mol/L黄芩苷组；5：缺氧复氧＋0.2×10–3 mol/L黄芩苷组　ZO–1：Zonula Occludens 1；NF–κB(P65)：nuclear factorκB(P65)；1：normal control group；2：hypoxia reoxygenation group；3：hypoxia reoxygena-tion＋5×10–3 mol/L Baicalin group；4：hypoxia reoxygenation＋1×10–3 mol/L Baicalin group；5：hypoxia reoxygenation＋0.2×10–3 mol/L baicalin group

图1
Occludin、ZO-1和NF-κB(P65)的蛋白表达
Figure 1
Expressions of Occludin，ZO–1 and NF–κB(P65)protein
2.4　Occludin和ZO-1 mRNA表达

缺氧复氧组Occludin和ZO-1的mRNA表达量明显低于对照组，黄芩苷组随黄芩苷浓度增加，Occludin和ZO-1的mRNA表达量升高(F＝333.363、963.658，P均<0.05)，见表2。

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表2

大鼠小肠上皮细胞Occludin和ZO-1的mRNA表达量(±s)

Table 2

Occludin and ZO-1 mRNA ex-pressions of intestinal epitheial cell(±s)

表2

大鼠小肠上皮细胞Occludin和ZO-1的mRNA表达量(±s)

Table 2

Occludin and ZO-1 mRNA ex-pressions of intestinal epitheial cell(±s)

组别OccludinZO-1
对照组1.000±0.0001.000±0.000
缺氧复氧组0.493±0.0250.330±0.017
缺氧复氧＋5.0×10–3 mol/L黄芩苷组0.920±0.0260.787±0.021
缺氧复氧＋1.0×10–3 mol/L黄芩苷组0.783±0.0210.520±0.017
缺氧复氧＋0.2×10–3 mol/L黄芩苷组0.590±0.0170.073±0.015
3　讨论

研究表明，在严重感染、创伤、休克、心肺功能不全等病理过程中肠缺血再灌注损伤起重要作用。肠缺血再灌注损伤可引起消化道局部损伤，导致肠内细菌和毒素进入体循环，引发全身炎性反应，甚至导致多器官功能障碍。紧密连接蛋白表达量可直接反映肠缺血再灌注对肠黏膜屏障的影响[16,17]，采用肠道细胞缺氧复氧模型可模拟体外缺血再灌注[18]，因此本研究将IEC-6细胞置混合气中2 h，再置常规细胞培养环境中1 h制备肠上皮细胞的缺氧复氧模型，探讨黄芩苷对肠上皮细胞缺氧复氧损伤后屏障功能的影响。

氧化应激为缺血再灌注损伤的核心病理环节，当机体受创伤、缺氧、感染等各种致病因素严重打击时，大量中性粒细胞聚集，通过非酶促反应生成大量的氧自由基(reactive oxygen species，ROS)[19]，ROS可导致细胞膜脂质过氧化增强，引起肺内皮细胞、上皮细胞等损伤。ROS的终产物为MDA[20]，MDA对组织有毒性作用，其能与氨基化合物反应，使之发生交联，从而丧失其功能，MDA是判断ROS损伤的重要指标。SOD是体内最重要的自由基清除剂之一，能够催化超氧阴离子自由基发生歧化反应，消除体内ROS链式反应对机体的损害，而创伤、缺氧、感染时机体内ROS大量产生，导致SOD对抗ROS的氧化-抗氧化平衡作用失衡，造成机体损害[21]。本研究检测细胞上清中MDA和SOD的水平，结果显示缺氧复氧组较对照组MDA水平升高，SOD水平降低；黄芩苷降低了缺氧复氧细胞上清MDA水平，升高了SOD水平。推测，黄芩苷通过降低氧化应激，增加SOD活性，保护ROS清除系统，维持氧化-抗氧化平衡，减轻脂质过氧化反应及有害代谢产物对肠上皮细胞的损伤。

NF-κB是核转录因子，可调节许多基因的表达，对细胞凋亡的调控、病毒复制、肿瘤发生、炎性反应和各种自身免疫性疾病至关重要[22,23]。NF-κB包括5个亚单位：Rel、p65、RelB、P50和P52。实验中常采用p65代表NF-κB。在静息细胞中，NF-κB和NF-κB抑制蛋白(IκB)结合，以无活性形式存在于胞质中，当细胞受活性氧中间体、缺氧、蛋白激酶C催化剂等细胞外信号刺激后[24]，IκB磷酸化而后降解，使NF-κB释放，游离的NF-κB迅速移位到细胞核内。NF-κB是第一个被证明能被ROS激活的真核转录因子，二者间存在正反馈效应，ROS增强细胞质的信号途径，导致NF-κB向核内转运，从而将其激活。而黄芩苷可抑制NF-κB激活[16,25]。大鼠心肌细胞缺氧复氧检测[26]和肝缺血再灌注模型[27]证明黄芩苷通过抑制NF-κB激活以减少缺血再灌注损伤。本实验结果显示，黄芩苷溶液组NF-κB(P65)的蛋白表达量明显低于缺氧复氧组，且各组NF-κB(P65)的变化趋势与MDA一致，与SOD相反，NF-κB可被ROS激活，说明黄芩苷通过降低MDA水平，升高SOD水平来抑制ROS对NF-κB的激活。Occludin和ZO-1是紧密连接蛋白的重要组成蛋白，肠上皮细胞Occludin和ZO-1的表达可较直观地表现肠上皮细胞屏障功能，本结果显示，黄芩苷溶液组Occludin和ZO-1的蛋白、mRNA表达量明显高于缺氧复氧组，证明黄芩苷对肠上皮细胞屏障有保护作用。

综上，黄芩苷通过降低肠上皮细胞MDA水平、升高SOD水平抑制缺氧复氧对肠上皮细胞NF-κB的激活，减少缺氧对Occludin和ZO-1的破坏，对缺氧复氧造成的肠上皮屏障损伤起保护作用。

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黄芩苷
肠屏障
缺氧复氧缺血再灌注
紧密连接蛋白
超氧化物歧化酶
缺氧复氧损伤
肠上皮细胞
屏障功能
细胞增殖
比色法