手足口病可由多种肠道病毒引起，其中以肠道病毒71型和柯萨奇病毒A16型最为流行，各种亚型之间交替出现。早期诊断对患儿的及时治疗、预后改善具有重要意义。目前，其病原学的实验室检测方法主要包括病毒分离培养、反转录PCR、实时荧光定量PCR、反转录环介导等温扩增、酶联免疫吸附试验、中和抗体试验等。现就手足口病病原学及其检测方法的研究现状作一综述。
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手足口病主要由小RNA病毒科肠道病毒属成员引起，其中肠道病毒71型(EV71)和柯萨奇病毒A16型(CA16)最多见[1]。2007年EV71引起的手足口病首次暴发于山东省，2008年在全国范围内流行。2010年以来，手足口病发病人数连续5年位居传染病的首位，死亡人数居丙类传染病的首位，2014年发病例数仍有2 778 861例，死亡501例[2]，严重威胁儿童的生命健康。因此，早期诊断对于手足口病患儿的及时治疗、预后改善尤其重要，现将手足口病病原学及其检测方法在国内外的研究进展做一介绍。
手足口病可由肠道病毒A组中20多种成员引起，包括CA2、CA3、CA4、CA5、CA6、CA7、CA8、CA10、CA12、CA14、CA16和EV71。其中，EV71和CA16是手足口病的主要病原体[3]。少数肠道病毒B组成员也引起手足口病。
CA16属于小RNA病毒科肠道病毒属，为单股正链RNA病毒[4]。CA16型菌株可分为A、B1、B2 3种基因型，而B1基因型可继续分为B1a、B1b、B1c 3种亚基因型[5]。1951年在南非从患有迟缓性麻痹的乳鼠脑组织中分离出第1株CA16[6]，1957年由CA16引起的手足口病首次暴发于多伦多[7]。1995年B1基因型菌株最早在日本分离出，B1b基因型菌株和B1a基因型菌株共同循环，但是2004年以后，B1b基因型菌株成为优势菌株[8]。Chen等[8]研究报告表明B1a基因型菌株在日本、马来西亚、中国报道最多；而在中国大陆，B1b基因型菌株也是优势菌株，与B1a基因型菌株共同引起手足口病的流行。澳大利亚还连续鉴定出B1c基因型菌株。B2基因型菌株较少引起手足口病的流行，仅日本、马来西亚分离出B2基因型菌株，其他国家尚未报道CA16 B2基因型流行。当前流行的CA16 B型可能来源于CA16 A型与EV71型和CA4型基因重组[8]。有研究指出，人可以同时感染CA16和EV71，并且这种共同感染可以提高这2种病原体基因之间重组的可能性，这种现象或许可以解释2008年中国大陆手足口病暴发的原因[9]。
EV71也属于小RNA病毒科肠道病毒属A组的单股正链RNA病毒[10,11]，可分为A、B、C基因群。B基因群和C基因群又各自分成B1、B2、B3、B4、B5亚型和C1、C2、C3、C4、C5亚型，C4亚型进一步可分为C4a和C4b[12]。1969年首次从美国一脑炎患儿的粪便中分离出EV71[13]。自1997年起，EV71所致手足口病在亚太地区尤其是东南亚地区流行，其中日本以B5、C2和C4为优势菌株交替流行[14]；马来西亚多次暴发EV71，以C1、C2、B3、B4、B5亚型为优势菌株[15,16]；泰国以B5和C4亚型为EV71主流菌株，C1和C2亚型菌株引起散在手足口病发生[17]。C2、B4、C4、B5、C5亚型菌株先后在中国台湾暴发流行[18,19,20]。而在中国大陆仅发现C4亚型菌株暴发流行，其中C4b亚型在1998年至2001年流行，2002年至2004年C4a和C4b共同循环，2005年之后仅C4a亚型流行[21]。在大规模流行期间基因型别发生替换，经基因重组诱导这些病毒突变形成新的基因菌株逃离免疫，导致不同型别病毒重新出现[22]。内部基因重组在EV71不同亚型流行方面起重要作用。
除EV71和CA16外，还有其他肠道病毒可引起手足口病。2009年我国山东临沂暴发手足口病，有21%的患儿由CA6、CA10、CA12、CB5(coxsackievirus B5，CB5)引起，而在2011年手足口病阳性病毒检测病例中，有38%由CA2、CA4、CA6、CA12、CB1、CB4、E6(echovirus 6，E6)、E30导致[23]，多种肠道病毒共同循环在手足口病病原体进化方面起了重要作用[22]。He等[24]报道的手足口病27.9%由CA6、CA21、CB2、CB5、E16、E25引起。2012年江苏省发现全球第1例由E24引起的手足口病[25]。在泰国暴发的手足口病中，除EV71和CA16流行外，CA4、CA5、CA6、CA8、CA9、CA10、CA12、CA21、CB1、CB2、CB4、CB5、E7也引起手足口病[26]。Cabrerizo等[27]报道指出，CA6也可导致手足口病暴发，CA2、CA4、CA5、CA8、CA14、E18和CB4引起散在病例发生。
早期诊断手足口病对其治疗及疫情控制有重要意义。目前手足口病的实验室检测方法主要有病毒分离培养、反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、实时荧光定量PCR(qRT-PCR)、反转录环介导等温扩增(RT-LAMP)、酶联免疫吸附试验(ELISA)、中和抗体试验。
病毒分离是诊断手足口病的一个精确方法。用于培养肠道病毒的细胞包括人横纹肌肉瘤(RD)细胞、非洲绿猴肾细胞(Vero)、Hep-2、LLC-MK2、海拉细胞(Hela)、人胚胎成纤维细胞(MRC-5)和L20B[19,28,29,30,31,32,33]。但RD细胞最常用来分离培养及鉴定EV71和CA16。通常取患者的咽拭子、肛拭子或粪便、疱疹液制成悬液[12,19]，取上清接种于敏感细胞中进行扩增培养，一般需要7～14 d[33]。然而，Hsueh等[34]通过尸检取下的组织进行病毒分离培养，经特异性的单克隆抗体与病毒结合，通过间接免疫荧光法进行病毒鉴定。分离后的病毒还可以结合其他方法，如RT-PCR和qRT-PCR方法进行检测[8,35]。Jiang等[36]用病毒分离培养法检测肠道病毒阳性率仅占3.6%。而用RT-PCR法检测阳性率为68.5%。Chiang等[28]用病毒分离联合间接免疫荧光法完成病毒培养和分型需要5～14 d。病毒分离培养法是诊断手足口病的金标准，但病毒培养时间长，阳性率低，对早期诊断帮助不大；另外，培养病毒需要二级生物安全实验室及生物安全柜，技术人员需专业培训，在大多数基层医院无法开展，限制了它的应用。
分子生物学的飞速发展，为病原体的检测提供了可靠技术手段。在手足口病核酸检测时，一般针对高度保守的5'-UTR非编码区进行扩增。目前已有很多研究者分别根据这些位点设计特异性引物和探针。Yan等[37,38]根据VP1基因序列和5'-UTR非编码区设计了一套半巢式RT-PCR引物，可检测EV71、CA16和其他肠道通用病毒。有学者通过设计正向引物(OL26或MD91)和反向引物(OL27或OL68-1)，采用一步法RT-PCR扩增5'-UTR和5'-UTR-VP4-VP2基因序列，对600份手足口病患儿咽拭子、粪便、疱疹液、脑脊液样本进行EV71、CA16及肠道通用病毒的特定基因检测，阳性标本549份，阳性率91.5%[39]。而对其中的阳性标本进行病毒培养法只有307例为阳性，阳性率为55.9%。显然，RT-PCR法敏感性高于病毒培养法。Jiang等[31]建立的一种双重RT-PCR法，可在单管中同时检测EV71和其他肠道通用病毒，引物经筛选优化后，对EV71和其他肠道病毒RNA滴度的检出下限分别为1×10-6 TCID50/L和1×10-5 TCID50/L。在165例临床样本中，双重RT-PCR检测EV71阳性率占46.1%，其他肠道病毒阳性率占22.4%，特异性为100.0%。而用病毒分离培养法检测肠道病毒阳性率仅为3.6%。病毒核酸在症状出现后的第2天可在粪便中检测到，因此RT-PCR技术可用于手足口病感染的早期诊断，其敏感度和特异度均较高，是目前手足口病病原学检测的主要方法。
由于手足口病可以由多种病毒引起[40,41,42]，Cui等[43]建立了一种新颖的基于广谱实时杂交探针的qRT-PCR，几乎对所有的肠道病毒检测都有特异性。针对5'-非编码保守区设计了用于扩增肠道通用病毒引物[上游引物EV(YG)F和下游引物EV(YG)R]和探针EVTY(YG)PB。与此同时，Cui等[43]根据GeneBank中公布的EV71和CA16 VP1基因序列，设计了双重qRT-PCR能同时特异性检测EV71和CA16。其在EV71和CA16的5'-末端用不同标记的荧光探针标记，即VIC和FAM。通过发射光谱产生的2种不同荧光信号加以区分同一管中的EV71和CA16混合反应体系，整个过程只需1～2 h。在213例手足口病临床标本中，用双重qRT-PCR法检测EV71和CA16总阳性率为69.48%(148/213例)。然而，用病毒分离培养法和常规RT-PCR方法检测总阳性率分别为34.74%(74/213例)和47.42%(101/213例)，可以看出qRT-PCR比常规RT-PCR和病毒分离培养法的敏感度都要高。Zhang等[44]设计的一步三重qRT-PCR法可以同时检测EV71、CA16和肠道通用病毒，解决了多次检测病原体的操作过程。该方法克服了多套引物和探针在同一管中反应时的相互干扰，减少了工作负荷和费用，成为手足口病快速筛选的一种方法。该法检测EV71、CA16和肠道通用病毒敏感度分别为98.7%、100.0%和98.4%，对其他病毒特异度为100.0%。
qRT-PCR法快捷、敏感度高、特异性强，其中双重、三重qRT-PCR能在一次检测中同时对2种/3种病毒进行特异性筛选，提高了检测效率；而广谱qRT-PCR试验阳性，能提示有肠道病毒感染，但无法确定为哪一种病毒。
常规RT-PCR法需要PCR仪，qRT-PCR法需要光信号采集系统和计算机分析处理系统，局限了其在手足口病疫情暴发时大规模检测中的应用。为了解决这一问题，Jiang等[36]建立了一种可检测EV71所有亚型的RT-LAMP。该法针对VP3基因设计了2个内部引物、2个外部引物和2个环状引物，在提取标本病毒RNA后，直接用水浴加热处理，在63 ℃恒温条件下扩增35 min，再用80 ℃水浴5 min后终止反应。扩增后的产物加入荧光检测试剂，可直接在自然光下或者紫外光下用肉眼观察。与qRT-PCR相比，其敏感度为92.9%(26/28例)，特异度为100.0%(12/12例)。该方法对细胞培养的病毒RNA检出限度为0.01 PFU，与其他常见病毒如CA16、CB3、CB5、腺病毒3型、H5N1禽流感病毒等无交叉反应。Nie等[45]在Jiang等[36]的基础上改良，运用了一种特异性检测EV71的直接RT-LAMP，该法不用提取病毒RNA，但需95 ℃热处理30 s后冰浴2 min，延长水浴时间至75 min。与RT-LAMP法相比，其敏感度和特异度分别为90.3%和100.0%；与qRT-PCR相比，其敏感度和特异度分别为86.8%和100.0%。目前，RT-LAMP法与直接RT-LAMP法主要用于科研，需要增大样本量来对其敏感性、特异性和临床实用性进行验证。
人感染EV71和CA16后，用ELISA法最早可从发病1 d后检测出患儿血清中特异性IgM抗体，3～4个月后检测消失。EV71感染后5 d，阳性率达100%。而CA16在发病8 d后，阳性率达100%，可以用于早期快速检测[30]。但是EV71-IgM和CA16-IgM ELISA之间会产生交叉反应，假阳性率分别为31.1%和27.5%[30]。针对这一问题，Wang等[32]通过蛋白免疫印迹法发现，在感染CA16后，血清中产生的IgM抗体与EV71 VP3结合产生假阳性信号。Wang等[32]在Yu等[30]的基础之上设计了一种新的EV71-IgM抗体捕获ELISA法，用EV71 VP1蛋白代替EV71病毒颗粒与抗体结合，从而改善检测EV71的特异性。因此，利用VP1位点可作为EV71抗原试验的一个靶点。在检测健康儿童血清抗体时，VP1-IgM抗体检测法的特异性为99.5%，而病毒颗粒-IgM抗体检测法为95.6%。由此可见，基于EV71 VP1的IgM抗体检测法比基于EV71 VP3的IgM抗体检测法更具特异性。但是，IgM抗体在体内可长达3～4个月，单份标本检测为阳性难以区别是近期感染还是曾经感染，需要取急性期、恢复期双份血清进行效价对比加以证实。
当肠道病毒侵入人体以后，人体在抵抗肠道病毒感染的过程中产生较高水平的IgG，且在体内存续时间长达2个月[46]。Yang等[47]研究发现，人感染EV71发病1 d后，可以在血清中检测到EV71中和抗体，发病后2 d达峰值。发病1 d后患儿的中和抗体几何平均滴度(GMT＝24.3)是健康对照组儿童(GMT＝7.4)的3倍多。但该法需要对采集的血清进行不同浓度稀释与固定量的病毒37 ℃ 50 mL/L二氧化碳孵育2 h后接种于人RD细胞中，培养至少4～7 d，对手足口病的早期诊断帮助不大，多用于血清流行病学调查及肠道病毒分离后的血清学分型[28]。
综上所述，多种肠道病毒可以导致手足口病，已有多种检测手段可对其进行检测，但各有优势及局限性。病毒培养及病毒核酸检测是重要的确诊依据，目前常规RT-PCR法应用最为广泛。环介导等温扩增RT-LAMP法检测病原更为简便、经济，更具应用前景，但需要对其敏感性、特异性、临床实用性进行大样本验证。
