通过1例疑诊黏多糖病11年终获确诊的家系，对黏多糖贮积症Ⅶ型进行研究。
患儿，女，12岁时来院，主因"发现骨骼畸形11年，疑似黏多糖病"就诊，对临床表现及影像学特点进行分析，取外周血白细胞进行溶酶体酶活性分析和基因分析。母亲第2次妊娠19周时抽取羊水，通过羊水细胞基因分析进行产前诊断。
患儿1岁时家长发现其肋缘外翻、鸡胸，疑诊"骨发育不良"。患儿智力正常，易疲劳，11年来进行性骨骼改变，面容粗陋，大头，体格发育落后，12岁时身高为147 cm(－1 SD)。X线检查显示双侧锁骨、肋骨略增粗，脊柱略呈S型弯曲，部分椎体变扁，腰椎以L3为中心后突畸形，L3、L4椎体前缘呈"鸟嘴样"改变。超声心动图显示主动脉瓣叶增厚，关闭不良，二尖瓣前叶略厚，瓣尖对合欠佳。外周血白细胞溶酶体酶活性分析显示β-葡糖醛酸苷酶显著降低[0.2 nmol/(g·min)]，符合黏多糖贮积症Ⅶ型。GUSB基因分析显示患儿存在c.1832G>C(p.R611P)和c.1244＋3G>C(剪切)2个突变，父母各携带1个杂合突变，均为未报道的新突变。患儿母亲羊水细胞GUSB基因仅存在c.1832G>C突变，明确胎儿为携带者，未患与先证者相同的疾病。
黏多糖贮积症Ⅶ型是一种严重的进行性退行性疾病，诊断困难，预后不良，迄今尚无有效治疗方法。β-葡糖醛酸苷酶活性测定及GUSB基因分析是确诊的关键技术。本例患儿为中间型，GUSB基因存在2个新突变，母亲第2次妊娠中期通过羊水细胞基因分析对胎儿成功进行了产前诊断。
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黏多糖贮积症Ⅶ型(MPSⅦ)1973年由Sly及其同事首次报道，因此也称作Sly综合征[1,2,3]，是一种非常罕见的黏多糖贮积症亚型。MPSⅦ是由于溶酶体β-葡糖醛酸苷酶缺陷导致3种黏多糖(硫酸皮肤素、硫酸乙酰肝素和硫酸软骨素)降解障碍，在溶酶体内沉积，导致许多组织和器官功能进行性损害[2,3,4]。患者临床表现复杂多样，轻者可延至成年发病，重型可表现为胎儿水肿，多数患者为中间型，主要表现为智力障碍、面容粗陋、肝脾大、肺功能障碍、心血管并发症、关节僵硬、身材矮小和多发性骨发育不良等[5]。其中心脏损害及呼吸道阻塞是导致MPSⅦ患者死亡的主要原因[2,5]。编码β-葡糖醛酸苷酶的基因为GUSB(MIM 611499)[1]，位于常染色体7q11.21，由11个内含子和12个外显子组成[6]。目前对于MPSⅦ尚无有效的治疗方法，我国尚无此研究。本研究拟通过对1例诊断困难的MPSⅦ患儿的临床经过、影像、酶缺陷及GUSB新突变进行研究，对MPSⅦ的临床特点、诊断及产前诊断的方法进行研究。
患儿，女，12岁，因"骨骼畸形，疑似黏多糖病11年"就诊。患儿1岁时家长发现其肋外翻、鸡胸，检查提示"骨发育异常，疑似黏多糖病？"未明确诊断。1岁后进行性骨骼改变，面容粗陋，大头，自幼双肘关节无法伸直，双肩关节活动受限，无肌肉及骨骼疼痛。智力发育正常，易疲劳，体格发育落后，平均每年身高生长5 cm左右。5岁时发现"X"型腿(图1)。6岁时发现双眼弱视、散光，无角膜浑浊；并发现主动脉瓣功能不全，二尖瓣关闭不全，射血分数为59%～70%，无动态下降。9岁时因"肺炎合并右侧脓胸"，一度心肺功能不全，治疗2个月后好转。患者出牙时间正常，但换牙后牙齿细、尖、小。10岁时月经初潮，月经规律。既往曾于多地就诊，进行溶酶体酶活性测定，但未能确诊。
注：指骨(A)、腕骨(A)、肋骨(B)、脊柱(B、C)、膝关节(D、E)、左侧髋臼(F)多发骨发育不良及变形 Multiple dysostosis and deformation were observed in hand (A)，wrist (A)，ribs (B)，spine (B and C)，knee－joint (D and E) and left acetabulum (F)
出生史及家族史：患儿为其父母第1胎，第1产，母亲孕期顺利，足月自然分娩出生。父亲及母亲健康，为非近亲婚配，双方无类似疾病家族史。
本研究已征得患儿家长知情同意，并签署知情同意书，同时获医院医学伦理委员会批准。
精神反应良好，身高147 cm，为－1 SD，体质量44 kg，头围54 cm。面容粗陋，头发黑，浓密，眼距宽，角膜清，鼻梁低平，嘴唇肥厚，齿列不齐，全身未见皮疹和出血点，浅表淋巴结未触及明显肿大。可见双侧手镯征，脚镯不明显，双肘、双肩关节伸展受限，脊柱轻度侧弯，双下肢呈X型。呼吸平稳，可见鸡胸，肋下缘略外翻，未见"郝氏沟"，肋骨无串珠样改变，双肺呼吸音清，未闻及啰音。心率90次/min，心音有力，律齐，可闻及SM Ⅱ～Ⅲ/6级吹风样杂音。肝脾肋下未触及。四肢肌力、肌张力正常，双侧跟腱及膝腱反射正常，双侧巴氏征阴性。双侧眼底检查未见异常。
(1)常规化验：血液及尿液常规化验未见异常，肝肾功能、肌酶、碱性磷酸酶正常。(2)骨骼X线检查：四肢骨质疏松，骨小梁结构紊乱，尺桡骨远端关节面及第1掌骨近端关节面骨质粗糙变细，尺桡骨中段向对侧弯曲交叉。桡、尺骨远端倾斜状呈"V"字形。左侧腕部可见8枚腕骨化骨核，腕骨较分散，小而不规则，骨龄相当于正常女童9岁水平(图1A)。胸廓塌陷，双侧锁骨、肋骨略增粗，双侧肋骨远端增宽，脊柱端变细，似船桨(图1B)。脊柱略呈S型弯曲，部分椎体变扁(图1B)。腰椎各椎体骨质密度不均，以L3为中心向左后凸弯，L2椎体后滑，椎体体积变小，前上缘缺如，前下缘呈"鸟嘴样"改变，L1～2椎体向后成角，L1～2、L2～3椎间隙略变窄(图1C)。双膝关节外翻，双侧胫骨近端骨骺线尚未完全闭合(图1D、图1E)。左侧髋臼发育不良，左侧股骨头关节面塌陷，可见不规则骨质破坏，边缘硬化(图1F)。(3)生殖系统超声检查：未见异常。(4)心血管系统检查：心电图未见异常。多次超声心动图显示左心室增大，室间隔及左、右心室壁厚度正常，收缩幅度正常。左心室射血分数为59%～70%。主动脉瓣叶增厚，关闭不良，二尖瓣前叶略厚，瓣尖对合欠佳。心包腔未见异常。提示主动脉瓣大量反流，二尖瓣少量反流，三尖瓣微量反流。
β-葡糖醛酸苷酶活性显著降低，为0.2 nmol/(g·min)[正常值69.7～236.2 nmol/(g·min)]，是正常对照低值的0.29%，符合MPSⅦ。其父母外周血白细胞β-葡糖醛酸苷酶活性正常，分别为75.9 nmol/(g·min)、71.1 nmol/(g·min)。
在知情同意前提下抽取患儿及其父母静脉血3～5 mL，提取外周血白细胞DNA，采用Miller盐析法提取外周血白细胞基因组DNA。运用新一代基因测序技术进行相关基因突变分析，均采用一代测序方法验证，并对患儿父母及正常对照进行突变分析。由NCBI(National Center for Biotechnology Information)网站下载GUSB基因DNA全序列，GenBank ID为2990，采用Primer5软件设计PCR引物进行扩增。胶回收以及纯化后，采用双向测序法进行基因序列分析，后与标准序列进行比对分析。对检测出的突变在千人基因组网站进行单核苷酸多态性(SNP)检测(http：//www.1000genomes.org)，致病性预测及保守性测定在Mutation Taster网站分析(http：//www.mutationtaster.org/)。
患儿GUSB基因存在c.1832G>C (p.R611P)和c.1244＋3G>C (剪切)复合杂合突变，支持MPS Ⅶ型诊断。患儿父母各携带1个突变，母亲存在杂合c.1244＋3G>C突变，父亲存在c.1832G>C(图2)，均为未报道的新突变。
注：患儿GUSB基因存在c.1832G>C和c.1244＋3G>C复合杂合突变，母亲携带c.1244＋3G>C突变，父亲携带c.1832G>C，胎儿也为c.1832G>C突变携带者，正常对照均未检出上述2种突变 OnGUSB gene of the patient，two novel mutations，c.1832G>C (p.R611P) and c．1244＋3G>C (splicing)，were identified.Her mother carried c．1244＋3G>C mutation.Her father carried c．1832G>C.The fetus also carried c．1832G>C.Any of the 2 mutations was not found in the controls
GUSB基因突变致病性分析：在GenBank上查找GUSB cDNA和基因组序列，通过EXPASy Translate Tool(http：//web.expasy.org/translate/)翻译成相应蛋白质。GUSB c．1832G>C突变导致其编码的GUSB蛋白第611位的精氨酸变成了脯氨酸(p.R611P)。c.1244＋3G>C为剪切突变，推测可能造成功能缺失。在200例健康对照及人类基因突变数据库(HGMD)及千人基因组计划资料库中未检出，经SIFT和Polyphen-2软件致病性预测及多物种同源性分析，c.1832G>C突变位置在哺乳动物中高度保守(表1)，提示十分可能致病。
人、黑猩猩、猕猴、红鳍东方魨、鸡、果蝇的GUSB蛋白同源序列
Amino acid alignment in GUSB protein residues of Human，Pan troglodytes，Macaca mulatta，Trubripes，Ggallus and Drosophila melanogaster
人、黑猩猩、猕猴、红鳍东方魨、鸡、果蝇的GUSB蛋白同源序列
Amino acid alignment in GUSB protein residues of Human，Pan troglodytes，Macaca mulatta，Trubripes，Ggallus and Drosophila melanogaster
| 物种 | ……GUSB蛋白611位氨基酸…… |
|---|---|
| 人类 | ……GNKKGIFTRQRQPKSAA…… |
| 黑猩猩 | ……GNKKGIFTRQRQPKSAA…… |
| 猕猴 | ……GNKKGVFTRQRQPKSAA..... |
| 红鳍东方魨 | ……GNKKGVFTRQRQPKA…… |
| 鸡 | ……GNKKKGIFTRQRQPKSA……. |
| 果蝇 | ……GNKKGVFTRAR…… |
目前患儿12岁6个月，智力运动发育正常，小学六年级毕业，学习中等水平。鉴于目前没有针对MPSⅦ的有效治疗方法，采取对症治疗及营养支持，避免剧烈运动，保护骨关节及心肺功能。
患儿母亲于第2次妊娠中期时来院咨询，孕19周时抽取羊水，分离羊水细胞，羊水染色体核型分析正常，羊水细胞GUSB基因存在c.1832G>C突变，明确胎儿为与父亲相同的携带者(图2)。患儿母亲孕38周时自然分娩，新生婴儿健康，脐带血β-葡糖醛酸苷酶活性正常，验证了产前诊断。
MPSⅦ是一种罕见的常染色体隐性遗传病，由GUSB基因突变导致β-葡糖醛酸苷酶缺陷，引起黏多糖降解障碍。关于MPSⅦ的发病情况，国内外均缺乏流行病学数据。患者的主要临床特点为骨骼畸形，一些患者伴角膜浑浊、肝脾大和智力障碍，个体差异显著[1,2,3]。严重患者于胎儿时期发病，表现为胎儿水肿，出生后呼吸困难，肝脾大，多脏器损害，多于新生儿期～婴儿期死亡[1,3,5]。轻者表现为晚发型，多数患者智力正常，以骨骼损害为主，患者可存活至50岁左右[8,9]。多数患者表现为中间型，主要表现为进行性骨关节损害，导致体格发育落后、骨骼畸形，患儿面部粗糙、J型蝶鞍、大头畸形、颧骨扁平、短颈、鸡胸、四肢屈曲挛缩、脊柱侧弯、脊柱后凸畸形、髋臼发育不良、马蹄足等。脊柱畸形较常见，可影响患者的生活质量，可以接受手术治疗[10]。由于黏多糖在多脏器的蓄积，患者常合并多系统损害，导致腹股沟疝、脐疝、淋巴水肿、肝脾大、腹水、心脏瓣膜异常、动静脉畸形、听力障碍、角膜混浊、反复呼吸道感染、多毛、肌张力减低、认知障碍、脑积水、智力运动障碍[2,5]。本例患儿智力发育正常，仅表现为面容粗陋、骨骼畸形和心功能损害，符合MPSⅦ型中间型。
β-葡糖醛酸苷酶是一个相对分子质量为332 000的糖基水解酶，水解溶酶体内黏多糖末端的β-葡萄糖醛酸[11]。人类β-葡糖醛酸苷酶由651个氨基酸残基组成，包括一个22-残基-长信号肽和4个潜在N-连接糖基化点。4个亚基形成一个酶活性四聚体[11]。β-葡糖醛酸苷酶是一个管家酶，在大多数组织中表达，并且参与溶酶体内蛋白聚糖的降解，在硫酸皮肤素、硫酸乙酰肝素和硫酸软骨素降解过程中起到非常重要的作用。因此，β-葡糖醛酸苷酶缺乏导致硫酸皮肤素、硫酸乙酰肝素和硫酸软骨素降解障碍，沉积于多种组织的溶酶体内，导致细胞和器官的功能障碍[2,3,4]。患者尿中硫酸皮肤素、硫酸乙酰肝素和硫酸软骨素多显著增高，可作为疾病的筛查指标[12]。
GUSB基因是目前已知的编码β-葡糖醛酸苷酶的基因，迄今已报道了50种不同类型的突变，其中90%为点突变(http：//www.hgmd.cf.ac.uk/docs/login.html)。本例患儿GUSB第10号外显子和第6号外显子分别存在c.1832G>C和c.1244＋3G>C复合杂合突变，父母各携带一个杂合突变。其中c.1832G>C突变导致β-葡糖醛酸苷酶蛋白第611位的精氨酸变成了脯氨酸，c.1244＋3G>C是剪切突变，可影响功能缺失。国外曾报道过c.1244＋1G>A的致病性[13]。这2个突变共同影响β-葡糖醛酸苷酶蛋白功能，患儿β-葡糖醛酸苷酶活性为0.2 nmol/(g·min)，仅为正常对照低值的0.29%，显著降低，符合MPSⅦ。患儿父母为携带者，β-葡糖醛酸苷酶活性分别为75.9 nmol/(g·min)和71.1 nmol/(g·min)，均在正常范围，与国外文献[14]报道一致，符合常染色体隐性遗传病的特点。
MPSⅦ患者临床症状复杂，诊断困难，对于疑似患儿可选择相关的实验室检查并咨询专业医师。基础性实验室检查包括血糖、血乳酸、血氨、血气分析、酮体、肝肾功能、心肌酶谱等，并应通过血液氨基酸及酯酰肉碱谱分析、尿气相质谱分析、尿黏多糖和寡糖分析鉴别氨基酸、有机酸、脂肪酸代谢病及黏多糖病，酶活性测定、组织活检或基因突变分析是确诊依据[15]。Shimada等[16]开发了血液6-硫酸软骨素的测定方法，可用于MPSⅣ A型及MPSⅦ的筛查。酶学检测和基因分析可用于携带者检测和产前诊断[2,17,18]。
对症治疗、支持性护理和并发症的治疗对延长生命、改善生存质量至关重要。国外一些机构对于MPSⅦ患者尝试进行了造血干细胞移植治疗和酶替代治疗。1998年Yamada等[19]对1例12岁的日本女童进行了异基因造血干细胞移植，患儿的运动功能改善，日常生活能力提高，减少了上呼吸道和耳道感染的频率，但认知功能没有明显提高。酶替代治疗虽然在少数其他类型的黏多糖病取得成功，但是尚未有被认可的治疗MPSⅦ型的药物。Fox等[20]对1例12岁晚期MPSⅦ美国女童进行了重组人类β-葡萄糖醛酸苷酶临床试验治疗，患儿肝肾肺功能有所提高，重新可以自主饮食，体质量增加，活动能力提高。基因治疗仅处于动物模型研究阶段[21]，还需要进行多方面的临床与实验室研究。
产前诊断是预防遗传性疾病再发的重要措施，在先证者病因诊断、基因型明确的基础上，在母亲下一次妊娠时可通过胎盘绒毛或羊水细胞的酶学或基因分析可进行MPSⅦ的产前诊断[5,17]。本例患儿母亲于再次妊娠19周时来北京大学第一医院儿科进行遗传咨询，希望对胎儿进行产前诊断。母亲妊娠中期采取羊水细胞进行胎儿基因分析，证实胎儿为GUSB突变携带者，表型正常，脐带血β-葡糖醛酸苷酶活性正常，出生后发育正常。
综上所述，MPSⅦ是一种罕见的溶酶体病，临床诊断困难，对于进行性骨关节损害、多脏器损害的患者，应高度重视，通过生化检查、影像学检查逐步进行鉴别诊断。外周血白细胞或皮肤成纤维细胞β-葡糖醛酸苷酶活性分析是疾病确诊的关键技术，基因分析有助于遗传咨询及产前诊断。本研究报告了我国首例中间型MPSⅦ，并发现了GUSB基因2个新突变。首次采用羊水细胞GUSB基因分析方法，帮助该家系进行了下一胎的产前诊断。
北京徳易东方转化医学研究中心及北京福佑龙惠遗传病专科门诊部的技术支持
