探讨性别、日龄、胎龄和出生体质量等因素与新生儿血中肉碱水平之间的关系，以期为新生儿筛查提供一个参考指标。
选取2012年7月至2015年12月在佛山市三水区妇幼保健院和中山大学附属第六医院新生儿科出生的490例新生儿为研究对象，根据出生日龄分为3组，出生1 d内为A组(207例)，2～3 d为B组(153例)，4～14 d为C组(130例)，采集足跟末梢血，用串联质谱技术测定血中游离肉碱(FC)、总脂酰肉碱(AC)和总肉碱(TC)水平，分析性别、日龄、胎龄和出生体质量对上述指标的影响。
新生儿血中TC和AC水平在出生14 d内呈现逐渐递减趋势。A组中性别、胎龄和出生体质量对TC、FC和AC各指标均有影响，男性、早产儿和低出生体质量儿高于女性、足月儿和正常出生体质量儿，差异均有统计学意义(P均<0.01)；C组中胎龄和出生体质量对FC和TC的影响出现了与A组一致的趋势(P均<0.01)；B组中各影响因素对上述指标的影响，差异均无统计学意义(P均>0.05)。
新生儿血中肉碱水平受日龄、胎龄和出生体质量影响，因此，新生儿筛查时要充分考虑上述因素对血中肉碱水平的影响。
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脂肪酸氧化紊乱是最常见的先天代谢性隐性遗传病之一，主要表现为急性、致命性的昏迷发作和低血糖[1]。通常情况下，症状是由中间代谢物蓄积引起，其中由脂酰CoA与左旋肉碱结合形成的脂酰肉碱具有典型的诊断价值[2]。新生儿期采用串联质谱技术筛查，很容易做到症状前诊断[1,3]。对新生儿血左旋肉碱和脂酰肉碱筛查的报道已有不少，但受到性别、年龄、胎龄和出生体质量等诸多因素影响，结果差异相当大[4,5,6,7]。目前，从多因素水平对血中左旋肉碱和脂酰肉碱进行研究的报道相对较少。因此，本研究从性别、日龄、胎龄和出生体质量等因素进行研究，以期为新生儿血左旋肉碱和脂酰肉碱筛查提供参考指标。
选择2012年7月至2015年12月在佛山市三水区妇幼保健院和中山大学附属第六医院新生儿病房住院的新生儿为研究对象，同时记录其性别、日龄、胎龄和出生体质量。本研究入选标准：(1)早产儿(胎龄28～36周出生)，无明显产前和产时窒息史，Apgar评分≥8分，血气分析pH和乳酸值未见明显异常；(2)足月新生儿(胎龄37～41周出生)，Apgar评分≥8分，血气分析提示pH和乳酸值在正常范围内；(3)所有新生儿(包括早产儿和足月儿)母亲既往无高血压、糖尿病及肾脏疾病等慢性疾病史，无结核、梅毒等感染性疾病史，无营养不良病史，无吸烟、酗酒、吸毒及滥用药物史。剔除标准：(1)后期跟踪证实有先天遗传代谢性疾病或肝肾功能异常的病例；(2)死亡病例。首先根据日龄分组，出生1 d内为A组，2～3 d为B组，4～14 d为C组，然后根据性别、胎龄、出生体质量和出生体质量与胎龄关系等影响因素进行分析，新生儿基本临床资料和分组见表1。期间共收集标本506例，其中日龄>14 d的9例，具有相同日龄的均不超过2例，不适于统计分析，以及日龄 ≤ 14 d的7例数据存在明显异常，均予以剔除。本研究获得受试新生儿监护人的知情同意，并经佛山市三水区妇幼保健院及中山大学附属第六医院医学伦理委员会批准。
不同日龄新生儿临床基本资料和分组(例)
Different age newborns′ clinical data and groups(n)
不同日龄新生儿临床基本资料和分组(例)
Different age newborns′ clinical data and groups(n)
| 组别 | 例数 | 性别 | 胎龄 | 出生体质量 | |||
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 男 | 女 | 早产儿 | 足月儿 | LBW | NBW | ||
| A组 | 207 | 127 | 80 | 123 | 84 | 131 | 76 |
| B组 | 153 | 93 | 60 | 87 | 66 | 93 | 60 |
| C组 | 130 | 69 | 61 | 73 | 57 | 86 | 44 |
| χ2值 | 2.560 | 0.422 | 0.872 | ||||
| P值 | 0.278 | 0.810 | 0.647 | ||||
注：以出生后日龄进行分组，1 d内为A组、2～3 d为B组、4～14 d为C组；LBW：低出生体质量；NBW：正常出生体质量
According to age in days after birth, within 1 day after birth for group A, 2－3 days for group B, 4－14 days forgroup C；LBW：low birth weight；NBW：normal birth weight
空腹状态下，采集新生儿足跟末梢血于血斑采集卡(美国Whatman 903号滤纸)上，形成一个直径1 cm、滤纸两面完全浸透的均匀血斑，室温条件下，平放自然晾干后，于4 ℃冰箱保存备用。
3200 QTRAP高效液相色谱串联质谱联用仪 (Applied Biosysterms，美国)，配套设备和分析软件分别为电喷雾化离子源 (electrospray ionization，ESI) 和ChemoView1.4.2；美国Agilent 1100型高效液相色谱仪。所选试剂纯度均为高效液相色谱级别，包括甲醇、正丁醇、乙酰氯、乙腈和保护氮气。
选用色谱柱为瑞典Kromasil C18(50.0 mm × 4.6 mm × 5.0 μm)，采用乙腈水溶液(15.4 mol/L)为流动相，四元泵流速为1 mL/min，进样量20 μL/次。采用母离子扫描方式，子离子m/z 85 Da片断，母离子扫描范围m/z 210～m/z 502。
ABI数据分析软件ChemoView 1.4.2对质谱数据处理，根据各丁酯化脂酰肉碱及其放射性核素内标的离子峰强度，由内标水平，自动计算所测样品脂酰肉碱水平。应用SPSS 19.0对数据进行统计分析，数据采用
±s和中位数(第5－95百分位数)表示，运用Shapiro－Wilk进行正态性检验，然后采用Kruskal－Wallis检验或Mann－Whitney U检验进行多样本和两独立样本分析，不同时间组两两比较采用扩展t检验。P<0.05为差异有统计学意义。
数据经Shapiro－Wilk检验显示非正态分布，然后进行Kruskal－Wallis检验，结果见表2。FC 、AC和TC水平在不同日龄组中均数不全相等；AC和TC随日龄增加逐渐降低，差异有统计学意义(P<0.05)；FC虽然在A组和B组间差异无统计学意义(P>0.05)，但二者与C组相比，差异均有统计学意义(P均<0.01)，见图1。
不同日龄组新生儿FC、AC、TC水平和AC/FC比值
The levels of FC，AC，TC and AC/FC ratio in neonatal blood with different age groups
不同日龄组新生儿FC、AC、TC水平和AC/FC比值
The levels of FC，AC，TC and AC/FC ratio in neonatal blood with different age groups
| 组别 | 例数 | FC(μmol/L) | AC(μmol/L) | TC(μmol/L) | AC/FC |
|---|---|---|---|---|---|
| A组 | 207 | 27.50±9.54 | 26.40±7.42 | 53.91±14.63 | 1.03±0.31 |
| 25.31(13.44～45.71) | 26.55(12.84～38.10) | 52.90(30.13～77.19) | 1.00(0.57～1.59) | ||
| B组 | 153 | 26.01±9.61 | 24.18±7.77 | 50.19±14.80 | 1.01±0.42 |
| 24.75(12.68～43.20) | 23.36(12.43～37.30) | 51.01(28.82～70.94) | 0.96(0.51～2.01) | ||
| C组 | 130 | 21.49±8.43 | 21.27±11.13 | 42.76±16.19 | 1.05±0.46 |
| 19.54(10.03～40.11) | 19.45(10.08～41.96) | 40.76(22.43～74.22) | 0.93(0.54～1.90) | ||
| χ2值 | 35.775 | 49.993 | 49.885 | 2.162 | |
| P值 | 0.000 | 0.000 | 0.000 | 0.339 |
注：以出生日龄进行分组，1 d内为A组、2 ～ 3 d为B组、4 ～ 14 d为C组；FC：游离肉碱；AC：总脂酰肉碱；TC：总肉碱；AC/FC：总脂酰肉碱与游离肉碱比值；每一个代谢产物值第1行为
±s、第2行为中位数(第5－95百分位数)
According to age in days after birth, within 1 day after birth for group A, 2－3 days for group B, 4－14 days forgroup C；FC：free carnitine; AC：total acylcarnitines; TC：total carnitine; AC/FC：AC/FC ratios; for each metabolite values were 
±s in the first line，and median (5th－95th percentiles) in the second line
The characteristics of alteration in concentrations of neonatal blood TC，AC and FC with different age
注：以出生后日龄进行分组，1 d内为A组、2～3 d为B组、4～14 d为C组；FC：游离肉碱；AC：总脂酰肉碱；TC：总肉碱；aP<0.05，bP<0.001
According to age in days after birth, within 1 day after birth for group A, 2－3 days for group B, 4－14 days forgroup C；FC：free carnitine；AC：total acylcarnitines；TC：total carnitine；aP<0.05，bP<0.001
The characteristics of alteration in concentrations of neonatal blood TC，AC and FC with different age
A组中性别、胎龄和出生体质量对FC、AC和TC各指标均有影响，男性、早产儿和低体质量儿高于女性、足月儿和正常体质量儿(P均<0.01); C组中胎龄和出生体质量对FC和TC的影响，出现了与A组一致的趋势(P均<0.01)；B组中，各影响因素对上述指标的影响，差异均无统计学意义(P均>0.05)，见图2。
The analysis of different factors affected the levels in neonatal blood TC，AC，FC and AC/FC ratio with different age
注：以出生后日龄进行分组，1 d内为A组、2～3 d为B组、4～14 d为C组；FC：游离肉碱；AC：总脂酰肉碱；TC：总肉碱；LBW：低出生体质量；NBW：正常出生体质量；aP<0.05，bP<0.01，cP<0.001
According to age in days after birth, within 1 day after birth for group A, 2－3 days for group B, 4－14 days forgroup C；FC：free carnitine; AC：total acylcarnitines; TC：total carnitine；LBW：low birth weight；NBW：normal birth weight；aP<0.05，bP<0.01，cP<0.001 with different age
The analysis of different factors affected the levels in neonatal blood TC，AC，FC and AC/FC ratio with different age
脂肪酸氧化紊乱是一类超过20种以上的先天性常染色体隐性遗传代谢病的总称[8]，世界范围内发病率约为1/9 000[9,10]。随着串联质谱技术的发展，国内外大型实验室利用串联质谱技术检测血中肉碱水平，使该类疾病的确诊率有了明显提高[1,3]。本研究利用串联质谱技术研究性别、日龄、胎龄和出生体质量等影响因素对血中TC、FC和AC水平的影响，结果发现TC和AC在出生14 d内呈逐渐降低趋势，而且早产儿和低出生体质量儿的TC和FC水平高于较足月儿和正常出生体质量儿。
以日龄分组研究显示，出生前14 d，血中TC和AC水平逐渐减少。有研究显示，适于龄儿出生后5 d TC和AC水平较脐带血高[11]，但该组随后的研究及最近国内的研究均与本研究相符[5,12]。较早的研究显示胃肠外喂养的早产儿需外源肉碱补充[13,14]；进一步研究显示，胎盘能主动代谢血中肉碱和脂酰肉碱并将其转移到胎儿[15]。因此，结合本研究和以往的研究推测，新生儿出生后肉碱水平有一个逐渐降低的过程，伴随自身合成能力逐步增强以及饮食补充的逐步稳定，又呈现一个逐步升高并渐趋稳定的趋势[5,12]。
男性新生儿TC、FC和AC水平略高于女性，但差异无统计学意义，这与已有的研究报道一致[4,7]。目前已发表的研究中有关胎龄对TC、FC和AC的影响结果尚不一致[4,7,11,12,16]，有研究显示血浆TC水平和胎龄无明显关系[4,7,11]，但Tokuriki等[16]的研究结果显示早产儿FC水平较足月儿低，而Meyburg等[12]的研究结果显示早产儿FC水平较足月儿高，后者与本研究结果一致。出生体质量对各检测指标的影响结果也不一致，有研究显示上述指标与出生体质量呈正相关[6,11]，也有研究显示与出生体质量呈负相关[7]。研究证实怀孕3个月后胎盘才具有转移肉碱进入胎儿血液循环的能力，因此，早产儿有面临肉碱缺失的风险[14]。同时有研究显示，胎龄相同的低体质量儿骨骼肌摄取肉碱的能力较正常出生体质量儿低[13]。结合本研究选取的早产儿胎龄均大于28周，此时胎盘已经有足够的能力转运肉碱至胎儿，而无论是在早产儿还是低出生体质量儿，均有存在骨骼肌摄取能力不足的可能，因此，TC和FC会出现较高的水平。
本研究的局限性在于标本主要集中在出生前14 d，在此年龄段TC和AC水平显示了很好的逐步递减趋势，那么整个新生儿期趋势是怎样呢？因此，在以后的研究中，需要进一步扩大标本收集的范围，从而保证标本的均衡性。本研究结果也证实新生儿血肉碱水平会受到日龄、胎龄和出生体质量等客观因素影响。此外，不同实验室硬件设备以及操作人员的技能可能也会对检测结果产生影响。因此，对新生儿血肉碱水平筛查分析时，首先应建立本实验室的检测标准；然后，结合临床表现及其他检验指标，有针对性地进行下一步基因或酶学检测，从而区别不同类型的肉碱缺乏，为进行合理有效地早期治疗提供辅助，从而达到早期诊断、早期治疗、减少后遗症的目的。
