检测肺炎支原体肺炎(MPP)患儿支气管肺泡灌洗液(BALF)中粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM－CSF)表达水平，探讨其在MPP中的临床意义。
收集2013年1月至2014年12月在苏州大学附属儿童医院呼吸科住院的40例MPP患儿BALF标本，30例患儿因病情治疗需要行第2次支气管肺泡灌洗，收集治疗后(恢复期)BALF标本，并采用酶联免疫吸附法检测GM－CSF和髓过氧化物酶(MPO)水平。同时收集患儿临床和实验室检查资料。以15例急性气管支气管异物患儿的BALF作为对照。
MPP患儿BALF中性粒细胞分类高于对照组[(62.1±23.5)%比(4.5±3.3)%，t＝2.73，P<0.01]。肺炎支原体DNA高值组(≥ 1010 copies/L)白细胞总数[(9.7±4.2)×109/L比(6.4±2.2)×109/L，t＝2.131，P＝0.04]和中性粒细胞数[(6.9±3.4)×109/L比(3.6±1.2)×109/L，t＝2.599，P＝0.01]均高于肺炎支原体DNA低值组(<1010 copies/L)。MPP患儿BALF中GM－CSF[(153.8±36.4) ng/L比(23.0±25.7) ng/L, P<0.05]和MPO[(21.4±7.0) ng/L比(13.8±3.5)ng/L，P<0.05]水平均明显高于对照组。MPP患儿BALF中GM－CSF水平与热程(r＝0.42，P<0.05)及MPO水平均呈正相关(r＝0.75, P<0.05)。恢复期GM－CSF和MPO水平均明显降低(均P<0.05)。
GM－CSF可能在儿童MPP发生发展中起重要作用，可作为疾病转归的有效预测指标之一。
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肺炎支原体肺炎(MPP)占儿童社区获得性肺炎的40%或更高，18%的患儿需住院治疗，其中0.5%～2.0%为危及生命的严重MPP[1]。近年来MPP的发病率逐渐上升，低龄患儿也很常见。肺炎支原体(MP)感染患儿的呼吸道内积聚大量的细胞因子和化学因子[2]，中性粒细胞和淋巴细胞等炎性细胞向肺组织迁移。中性粒细胞是人体先天性免疫的前哨细胞，在急性炎症时是主要参与者[3]，在MPP病理过程中发挥重要作用。MPP的一个重要病理特征就为肺部聚集大量的中性粒细胞，另一病理特征是由过氧化氢等引起的氧化应激反应。髓过氧化物酶(MPO)在中性粒细胞中大量表达，与氧化应激相关联，参与MPP的病理过程[4]。粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM－CSF)能够调节氧化应激活性。本研究通过检测MPP患儿支气管肺泡灌洗液(BALF)中GM－CSF和MPO的水平，探讨GM－CSF在儿童MPP中的意义。
选择2013年1月至2014年至12月在苏州大学附属儿童医院呼吸科住院的MPP患儿为研究对象。研究对象入选标准：(1)年龄4周～14岁；(2)入院时病程≤7 d；(3)MPP诊断标准参照第7版《诸福棠实用儿科学》[5]，采用定量酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清MP－IgM和IgG抗体浓度，血清IgM抗体浓度>1.1×103 U/L或双份血清IgG抗体增高4倍或以上提示急性感染；(4)均有纤维支气管镜检查指征，即胸部CT显示大片肺实变或肺不张(占据1个或以上肺段范围)。排除明确发现合并其他细菌或病毒感染者，有基础疾病或免疫功能缺陷者及资料不全者。共入选患儿40例。对照组15例，为同期在苏州大学附属儿童医院因急性气管支气管异物而住院的患儿，男8例，女7例；年龄(5.4±2.6)岁(1个月～12岁)。性别构成、年龄差异均无统计学意义(均P>0.05)。本研究取得入选研究对象监护人的知情同意，并获苏州大学附属儿童医院医学伦理委员会批准。
记录患儿性别、年龄、热程、住院时间，有无胸腔积液，入院24 h内的血常规白细胞计数、中性粒细胞比例、C反应蛋白(CRP)、乳酸脱氢酶(LDH)水平、发病后开始使用大环内酯类药物的时间、首次行纤维支气管镜肺泡灌洗的时间。
患儿于入院24 h内抽取患儿2 mL静脉血，采用ELISA检测血清MP抗体IgM和IgG。ELISA试剂盒为德国维润赛润公司提供，具体操作详见说明书。所有患者7～10 d后再次复查MP抗体。
40例MPP患儿于入院24～48 h行纤维支气管镜肺泡灌洗，其中30例患儿因病情需要(肺部炎症吸收不明显)于治疗后(恢复期)行第2次支气管肺泡灌洗，并收集2次支气管肺泡灌洗的标本，采集后立即15 000 ×g离心5 min分离上清保存在－80 ℃冰箱待测。GM－CSF和MPO检测采用ELISA法(试剂盒购自美国RB公司)，按照说明书进行操作，采用Bio－Tek Instruments公司(美国)uQuant型酶标仪检测样本吸光度值，通过标准曲线计算样本浓度值。
采用SPSS 17.0软件进行统计分析，计量资料以
±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD法。2组间比较资料为正态分布采用t检验，非正态分布采用秩和检验。计数资料比较采用χ2检验。相关性分析采用Pearson相关分析，P<0.05为差异有统计学意义。
MPP患儿的临床资料和实验室检查结果见表1。MPP患儿BALF中性粒细胞分类高于对照组[(62.1±23.5)%比(4.5±3.3)%，t＝2.73，P<0.01]。MP DNA高值组(≥ 1010 copies/L)白细胞总数[(9.7±4.2)×109/L比(6.4±2.2)×109/L，t＝2.131，P＝0.04]和中性粒细胞数[(6.9±3.4)×109/L比(3.6±1.2)×109/L，t＝2.599，P＝0.01]均高于MP DNA低值组(<1010 copies/L)。
MPP患儿的临床资料和实验室检查
Clinical data and laboratory tests of children with MPP
MPP患儿的临床资料和实验室检查
Clinical data and laboratory tests of children with MPP
| 指标 | MPP患儿 | |
|---|---|---|
年龄(岁， ±s) | 7.1±2.1 | |
| 男性[例(%)] | 23(53.5) | |
热程(d， ±s) | 16.0±3.4 | |
住院时间(d， ±s) | 11.2±4.2 | |
白细胞总数(×109/L， ±s) | 9.5±4.8 | |
中性粒细胞数(×109/L， ±s) | 6.4±3.3 | |
| C－反应蛋白[mg/L，M(P25～P75)] | 17.0(10.4～61.6) | |
乳酸脱氢酶(U/L， ±s) | 526.3±226.7 | |
免疫球蛋白A(g/L， ±s) | 1.4±0.8 | |
免疫球蛋白G(g/L， ±s) | 10.0±4.1 | |
免疫球蛋白M(g/L， ±s) | 2.2±1.2 | |
BALF中细胞分类( ±s) | ||
| 中性粒细胞 | 0.621±0.235 | |
| 淋巴细胞 | 0.088±0.077 | |
| 巨噬细胞 | 0.280±0.226 | |
| 影像学结果[例(%)] | ||
| 大片状或斑片状影 | 40(100.0) | |
| 胸腔积液 | 13(32.5) | |
注：MPP：肺炎支原体肺炎；BALF：支气管肺泡灌洗液
MPP：Mycoplasma pneumoniae pneumonia; BALF：bronchoalveolar lavage fluid
MPP患儿BALF中GM－CSF和MPO水平明显高于对照组(均P<0.01)；胸腔积液患儿的GM－CSF和MPO水平明显高无胸腔积液儿童(均P<0.05)，见表2。
对照组和MPP组患儿BALF中GM－CSF和MPO水平比较(ng/L，
±s)
Comparison of GM－CSF and MPO levels in children with MPP between control group and MPP group(ng/L，
±s)
对照组和MPP组患儿BALF中GM－CSF和MPO水平比较(ng/L，±s)
Comparison of GM－CSF and MPO levels in children with MPP between control group and MPP group(ng/L，±s)
| 组别 | 例数 | GM－CSF | MPO | |
|---|---|---|---|---|
| 对照组 | 15 | 123.0±25.7 | 13.8±3.5 | |
| MPP组 | 40 | 153.8±36.4a | 21.0±7.0a | |
| 胸腔积液组 | 13 | 164.8±24.0b | 25.1±9.7b | |
| 无胸腔积液组 | 27 | 148.5±40.4 | 19.5±4.4 | |
| F值 | 46.58 | 51.65 | ||
| P值 | 0.000 | 0.000 | ||
注：MPP：肺炎支原体肺炎；BALF：支气管肺泡灌洗液；GM－CSF：粒细胞巨噬细胞集落刺激因子；MPO：髓过氧化物酶；与对照组比较，aP<0.01；与无胸腔积液组比较，bP<0.05
MPP：Mycoplasma pneumoniae pneumonia；BALF：bronchoalveolar lavage fluid；GM－CSF：granulocyte macrophage colony stimulating factor；MPO：myeloperoxidase；compared with control group, aP<0.01；compared with children without pleural effusion，bP<0.05
患儿均使用阿奇霉素[10 mg/(kg·d)]和甲泼尼龙[1～2 mg/(kg·d)]进行治疗，均无严重的并发症(闭塞性细支气管炎、支气管扩张)发生。恢复期GM－CSF和MPO水平显著降低(P<0.05)，见图1。
注：MPP：肺炎支原体肺炎；GM－CSF：粒细胞巨噬细胞集落刺激因子；MPO：髓过氧化物酶
MPP：Mycoplasma pneumoniae pneumonia；GM－CSF：granulocyte macrophage colony stimulating factor；MPO：myeloperoxidase
MPP患儿BALF中GM－CSF水平与发热持续时间呈正相关(r＝0.42，P<0.05)，与其他临床参数无显著相关性。MPP患儿BALF中GM－CSF水平与MPO水平呈正相关(r＝0.75，P<0.05)，见图2。
注：MPP：肺炎支原体肺炎；BALF：支气管肺泡灌洗液；GM－CSF：粒细胞巨噬细胞集落刺激因子；MPO：髓过氧化物酶
MPP：Mycoplasma pneumoniae pneumonia；BALF：bronchoalveolar lavage fluid；GM－CSF：granulocyte macrophage colony stimulating factor；MPO：myeloperoxidase
MP是儿童社区获得性肺炎的重要病原体。严重病例常发生在学龄前儿童，X线检查呈大片或斑片影[6]。儿童感染MP的炎性反应程度与病情相关。目前，MP感染的机制尚不清楚，有关MPP患儿GM－CSF表达的研究尚未见报道。GM－CSF是由内皮细胞、成纤维细胞、巨噬细胞和活化的T淋巴细胞在细菌脂多糖(LPS)、白细胞介素－1(IL－1)和肿瘤坏死因子(TNF)－α等炎性因子的刺激下分泌的一种细胞因子，介导炎性反应，可激活中性粒细胞，并对中性粒细胞和巨噬细胞有直接趋化作用。本研究发现MPP患儿BALF中GM－CSF水平升高，胸腔积液患儿的GM－CSF水平明显高无胸腔积液儿童，提示GM－CSF在MP感染引起的中性粒细胞性炎症起重要作用。
中性粒细胞是MPP的致病机制中的关键细胞。新近研究发现，MPP患儿重症者较轻症者中性粒细胞的百分比、CD3＋CD25+细胞、IL－6、IL－10升高[7]。表明在MPP急重患者炎性反应上BALF中活化的T淋巴细胞和中性粒细胞增加可能发挥重要作用。本研究发现MPP患儿BALF中中性粒细胞高于对照组(P<0.01)。MP DNA高值组(≥1010 copies/L)白细胞总数和中性粒细胞数均高于MP DNA低值组(<1010 copies/L)，差异均有统计学意义(均P<0.05)，佐证了这一结果。
MPP患者中GM－CSF在MP与中性粒细胞之间发挥桥梁作用[8]。GM－CSF能提高中性粒细胞氧化应激功能[9]。同时，GM－CSF也可激活中性粒细胞[10]。在慢性肾脏疾病和血液透析患者中GM－CSF能提高中性粒细胞寿命和存活能力[11]。McDermott等[12]报道，GM－CSF在梭状芽孢杆菌感染的炎症信号网络中能招募中性粒细胞，却未发现清除病原体的能力。据此推测在MPP中GM－CSF可能无清除MP的作用，但能提高中性粒细胞的炎症和氧化应激活性。
MPO属于血红素过氧化物酶－环氧合酶家族，相对分子质量为150 000，大量表达于中性粒细胞、单核巨噬细胞中，是中性粒细胞的功能标志和激活标志[13]。MPO可催化过氧化氢和氯离子产生次氯酸等氧化剂，后者能够灭活入侵病原微生物蛋白质、多肽等物质，从而维持机体稳态[14]。在病理状态下，MPO介导产生具有氧化能力的氧自由基衍生物质，使蛋白质、DNA和脂质等生物分子产生氧化级联反应，导致慢性炎症进展性组织损伤和自身免疫性疾病[15]。MPO在肺炎支原体等感染的氧化应激中也起作用[4]。本研究发现MPP患儿BALF中MPO水平升高，胸腔积液患儿的MPO水平明显高于无胸腔积液儿童；与GM－CSF呈正相关(r＝0.75，P<0.05)，提示GM－CSF可提高中性粒细胞中MPO活性。Zipfel等[16]报道，有无N－甲酰甲硫氨酰基亮氨酰苯丙氨酸，GM－CSF均可激活中性粒细胞中的MPO。
本研究认为GM－CSF在MPP中具有重要作用。MP能够刺激支气管上皮细胞产生GM－CSF，后者能增加MPP患儿BALF中中性粒细胞数量并提高性粒细胞中MPO活性，进而发生病理生理反应。GM－CSF和MPO是否可作为评价和监测MPP患儿病情的有效指标，尚需通过大样本研究证实。
