探讨胆道闭锁(BA)婴儿嗜肝病毒和非嗜肝病毒感染情况，分析各种病毒感染与BA发生发展的关系。
收集2010年1月1日至2014年12月31日广州市妇女儿童医疗中心收治的184例BA婴儿的病历资料和病原学检测结果，分析3类嗜肝病毒即甲肝病毒(HAV)、乙肝病毒(HBV)、戊肝病毒(HEV)和5类非嗜肝病毒即巨细胞病毒(CMV)、EB病毒(EBV)、单纯疱疹病毒(HSV)、肠道病毒(EV)、柯萨奇病毒(Cox)感染情况；选用同期门诊和住院非BA的无免疫缺陷患儿结果作对照。
BA患儿3种嗜肝病毒(HAV、HBV、HEV)和5种非嗜肝病毒(CMV、EBV、HSV、EV、Cox)中，以CMV检出率最高(40.21%，39/97例)，HBV、HEV、EBV、HSV、EV、Cox检出率均较低，9例存在病毒混合感染；BA患儿检出的主要感染病原体CMV IgM阳性率[34.94%(29/83例)]显著高于对照组患儿[15.69%(8/51例)]，差异有统计学意义(χ2＝5.86，P<0.05)；CMV DNA定量检出率[28.57%(20/70例)]显著高于对照组患儿[3.70%(1/27例)]，差异有统计学意义(χ2＝7.10，P<0.05)；≤60 d组与>60 d组BA患儿CMV DNA检出率比较差异有统计学意义[45.45%(15/33例)比25.48%(5/37例)，χ2＝8.72，P<0.01]，但CMV IgM阳性率在≤60 d组、60～90 d组及≥90 d组比较差异无统计学意义[47.22%(17/36例)比20.00%(6/30例)比35.29%(6/17例)，χ2＝5.62，P>0.05]；CMV DNA检出组与未检出组BA患儿检测龄差异无统计学意义(P>0.05)。CMV DNA和CMV IgM 2种方法检测一致性较差(Kappa值<0.4)。
BA患儿CMV感染率高，≤60 d的小婴儿CMV DNA检出率最高，各年龄段患儿CMV IgM阳性率无明显差异，不支持CMV是BA的继发感染，CMV可能参与BA的发生发展。
版权归中华医学会所有。
未经授权，不得转载、摘编本刊文章，不得使用本刊的版式设计。
除非特别声明，本刊刊出的所有文章不代表中华医学会和本刊编委会的观点。
婴儿胆道闭锁(biliary atresia，BA)是一种进行性炎症性胆管病，治疗效果和预后差，病死率高，目前，其病因和发病机制仍不清楚，一般认为涉及病毒感染、自身免疫介导的胆管损伤、基因突变、胆道发育异常等学说。为了解广州地区可导致肝损伤的多种病毒感染情况，本研究分析2010至2014年广州医科大学附属广州市妇女儿童医疗中心184例BA婴儿嗜肝病毒和非嗜肝病毒感染情况，为探讨这些病毒感染与婴儿BA发生发展关系提供帮助。
收集2010年1月1日至2014年12月31日广州医科大学附属广州市妇女儿童医疗中心184例BA患儿病历资料。其中男109例，女75例，男女比例1.451.00；病理分型16例为 Ⅰ 型，168例为 Ⅲ 型。患儿明显肝大，部分患者肝脏质地较硬，呈褐色或淤胆样，肝表面粗糙呈颗粒样变或血管增粗，胆囊发育差，肝纤维化，可伴有腹水。3例行MRI或B超检查；98例行腹部探查术，手术年龄(94.39±42.65) d；83例同时行腹部探查术和葛西术(Kasai术)，手术年龄(75.22±21.85) d。患儿病理改变符合胆道阻塞性肝改变伴肝损害或肝硬化，患儿均符合BA诊断标准[1]。对照组选用同期门诊和住院非BA的无免疫缺陷患儿，各项目对应对照组分别是巨细胞病毒(CMV) IgM为神经康复科门诊和住院患儿，CMV DNA定量为内分泌病区患儿，EB病毒(EBV)衣壳抗原(CA)-IgM为儿童保健门诊和神经康复科患儿，乙肝病毒(HBV)表面抗原(HBs Ag)为保健科门诊患儿或先天性不完全性腭裂患儿。患儿监护人均签知情同意书，研究经医院医学伦理委员会批准。
分析3种嗜肝病毒包括甲肝病毒(HAV)IgM、HBV Ag、戊肝病毒(HEV)IgM，5类非嗜肝病毒即巨细胞病毒(CMV)IgM和DNA、单纯疱疹病毒(HSV) IgM，EB病毒(EBV)DNA和EBV CA-IgM，肠道病毒(EV)RNA、柯萨奇病毒(Cox)RNA结果。酶联免疫吸附试验(ELISA)检测BA患儿血清中各项抗体，HBV Ag和HEV IgM检测试剂厂家为上海科华生物工程股份有限公司，HAV IgM为珠海丽珠试剂股份有限公司，CMV IgM和HSV IgM为美国Trinity Biotech PLc公司。荧光定量PCR法检测患儿乙二胺四乙酸二钾(EDTA)抗凝血血浆中CMV DNA和EBV DNA，检测试剂为中山大学达安基因股份有限公司，荧光定量PCR检测咽拭子或肛拭子中的EV RNA、Cox RNA检测试剂均为广州华银医药科技有限公司。
采用Excel建立数据资料表，运用统计学分析软件SPSS 16.0对双向有序计量资料数据进行相关分析，各组间率的比较采用行×列χ2检验，两样本率的比较采用四格表χ2检验，当T<1或n≤40时采用Fisher′s精确检验，对非正态分布的两独立随机分布计数资料，则运用非参数检验Wilcoxon秩和检验。P<0.05为差异有统计学意义。
184例BA患儿中，可检出阳性的2项嗜肝病毒和5项肠道病毒阳性率，以CMV检出率最高(40.21%，39/97例)，HBV、HEV、EBV、HSV、EV、Cox检出率均低，见表1。可见9例混合感染，包括CMV与EBV或HBV混合感染各2例，CMV与HSV混合感染4例，CMV与HCV混合感染1例。BA患儿检出的主要感染病原体CMV IgM阳性率[34.94%(29/83例)]显著高于对照组(神经康复科门诊和住院)患儿[15.69%(8/51例)]，差异有统计学意义(χ2＝5.86，P<0.05)；CMV DNA定量检出率[28.57% (20/70例)]显著高于对照组(内分泌病区)患儿[3.70%(1/27例)]，差异有统计学意义 (χ2＝7.10，P<0.05)；EBV CA-IgM阳性率[8.70%(4/46例)]与对照组(儿童保健门诊和神经康复科)患儿[9.68%(3/31例)]比较差异无统计学意义(χ2＝0.07，P>0.05)；HBs Ag阳性率[1.14%(2/175例)]与对照组[保健科门诊患儿0(0/106例)或先天性不完全性腭裂1.03%(1/97例)]比较差异无统计学意义(χ2＝0.14、0.27，均P>0.05)。
BA患儿184例嗜肝病毒和非嗜肝病毒阳性率
The positive rate of hepadnaviruses and non－hepatotropic virus in 184 BA patients
BA患儿184例嗜肝病毒和非嗜肝病毒阳性率
The positive rate of hepadnaviruses and non－hepatotropic virus in 184 BA patients
| 病原体名称 | 检测项目 | 方法 | 样本类型 | 阳性[%(例)] |
|---|---|---|---|---|
| CMV | DNA | PCR | 血浆 | 28.57(20/70) |
| IgM | ELISA | 血清 | 34.94(29/83) | |
| EBV | CA-IgM | ELISA | 血清 | 8.70(4/46) |
| HSV | IgM | ELISA | 血清 | 5.19(4/77) |
| HBV | HBs Ag | ELISA | 血清 | 1.14(2/175) |
| EV | RNA | PCR | 肛拭子 | 0.71(1/14) |
注：BA：胆道闭锁；CMV：巨细胞病毒；EBV：EB病毒；HSV：单纯疱疹病毒；HBV：乙肝病毒；EV：肠道病毒；IgM：免疫球蛋白M；CA：衣壳抗原；HBs Ag：乙肝病毒表面抗原；ELISA：酶联免疫吸附试验 BA：biliary atresia；CMV：cytomegalovirus；EBV：Epstein－barr virus；HSV：herpesvirus hominis；HBV：hepatitis B virus；EV：enterovirus；IgM：immunoglobin M；CA：capsid antigen；HBs Ag：hepatitis B virus surface antigen；ELISA：enzyme linked immunosorbent assay
按检测龄不同，将BA患儿分为3组，不同年龄组BA患儿CMV DNA、CMV IgM和CMV阳性率见表2。CMV DNA定量检测，≤60 d组与>60 d组(60～90 d组与≥90 d 2组合并)BA患儿CMV DNA检出率差异有统计学意义(χ2＝8.72，P<0.01)；CMV IgM检测和CMV DNA＋CMV IgM合并分析显示，尚不能认为不同年龄段的3组BA患儿间CMV IgM(χ2＝5.62，P>0.05)或CMV检出率差异有统计学意义(χ2＝1.47，P>0.05)。
不同检测年龄组BA患儿CMV DNA及CMV IgM检测阳性率比较[%(例)]
Comparison of positive rate of CMV DNA and CMV IgM assay in BA patients among different age group[%(n)]
不同检测年龄组BA患儿CMV DNA及CMV IgM检测阳性率比较[%(例)]
Comparison of positive rate of CMV DNA and CMV IgM assay in BA patients among different age group[%(n)]
| 组别 | CMV DNA | CMV IgMb | CMV阳性(DNA/IgM中任一项阳性)b |
|---|---|---|---|
| ≤60 d组 | 45.45(15/33)a | 47.22(17/36) | 47.37(18/38) |
| 60～90 d组 | 14.29(4/28) | 20.00(6/30) | 34.88(15/43) |
| ≥90 d组 | 11.19(1/9)b | 35.29(6/17) | 37.50(6/16) |
| 合计 | 28.57(20/70) | 34.94(29/83) | 40.21(39/97) |
注：BA：胆道闭锁；CMV：巨细胞病毒；aBA患儿中，≤60 d与>60 d组CMV DNA检出率差异有统计学意义(χ2＝8.72，P<0.01)；b不同年龄组间CMV IgM阳性率(χ2＝5.62，P>0.05)或CMV阳性(DNA/IgM中任一项)检出率差异无统计学意义(χ2＝1.47，P>0.05) BA：biliary atresia；CMV：cytomegalovirus；ain BA patients，there was significant difference in CMV DNA detection rate between BA patients younger than 60 days and the ones older than 60 days(χ2＝8，72，P<0.01)；bthere was no significant diffe-rence in CMV IgM positive rate(χ2＝5.62，P>0.05)or CMV positive rate(either positive detection of CMV IgM or CMV DNA) (χ2＝1.47，P>0.05)among 3 age groups
184例BA患儿中，分别有70例CMV DNA和83例CMV IgM检测，2种方法同时测有56例，结果见表3，Kappa检验提示2种方法检测一致性较差(Kappa＝0.239)，差异无统计学意义(配对χ2＝0.239，P>0.05)。
胆道闭锁患儿56例CMV DNA与IgM结果一致性分析(例)
The consistency analysis of CMV DNA quantification and CMV IgM assay in 184 biliary atresia patients(n)
胆道闭锁患儿56例CMV DNA与IgM结果一致性分析(例)
The consistency analysis of CMV DNA quantification and CMV IgM assay in 184 biliary atresia patients(n)
| 检测项目 | CMV IgM阳性 | CMV IgM阴性 | 合计 |
|---|---|---|---|
| CMV DNA(≥5×105 copies/L) | 10 | 6 | 16 |
| CMV DNA(<5×105 copies/L) | 14 | 26 | 40 |
| 合计 | 24 | 32 | 56 |
注：CMV：巨细胞病毒 CMV：cytomegalovirus
CMV DNA检出组和未检出组，CMV IgM阳性组和阴性组BA患儿检测年龄分布见图1。CMV DNA检出组和未检出组间，或CMV IgM阳性组和阴性组BA患儿检测年龄总体差异均无统计学意义(两独立样本比较的秩和检验，Wilcoxon 检验，P>0.05)。
Comparison of the age distribution between BA patients with detected CMV DNA (or CMV IgM)and BA patients with undetected CMV DNA(or CMV IgM)
注：CMV：巨细胞病毒；BA：胆道闭锁 CMV：cytomegalovirus；BA：biliary atresia
Comparison of the age distribution between BA patients with detected CMV DNA (or CMV IgM)and BA patients with undetected CMV DNA(or CMV IgM)
BA是引起新生儿阻塞性黄疸最常见的原因之一，其与自发性新生儿肝炎共占新生儿胆汁淤积性疾病的50%～70%，BA在亚洲人群发病率约为1/8 000，在欧洲人群中发病率约为1/18 000，女婴发病数量较多，中国人发病率高于西方且呈上升趋势，中国台湾新生儿中发病率约为1/3 000，其中80%的病理在围生期获得，在胚胎期较少，可合并多种先天性异常。BA病因可能是多因素的，目前普遍认为病毒感染可能是导致BA的重要原因之一。
围生期的CMV感染很可能参与BA发生发展。已知肝内、肝外BA或非乙肝、丙肝的慢性肝炎患儿肝组织HCMV蛋白pp65阳性率达76.9%(10/13例)[2]；CMV阳性BA患者肝活检组织中CMV IgM沉积强度明显高于阴性者[3]；肝纤维化程度更严重[4]；CMV IgM阳性组比IgM阴性组Kasai术龄明显大，黄疸、肝组织炎症和纤维化更严重，天冬氨酸氨基转移酶(AST)值和AST/血小板计数比值更高，Kasai术后黄疸清除效能变低，患儿自身肝存活率减少，病死率增加[5]；而低剂量CMV可成功诱导调节性T淋巴细胞缺陷新生裸鼠肝内和肝外胆管上皮和血液指标发生多项类似BA患儿的变化[6]。
为进一步明确BA病因，本研究分析了各项嗜肝病毒和非嗜肝病毒感染情况，发现BA患儿CMV感染率为40.21%(39/97例)，CMV IgM阳性率为34.94%(29/83例)，与多数报道接近[3,4,7]，但低于Moore等[8]报道的95.24%(20/21例)，稍高于余家康等[9]报道的17.86%(5/28例)。CMV DNA检出率为28.57%(20/70例)，稍低于已有报道的42%(14/33例)[7]和40%(10/25例)[9]，低于血清CMV IgM与尿CMV DNA联合检测的50%感染率[3]，低于肝组织CMV DNA中60%(51/85例)[10]、58.82%(50/85例)[11]的检出率，低于Do Tommaso等[12]用PCR、组织学和血清学多种方法检测CMV的感染率[38.71%(12/31例)]，而高于Rauschenfels等[13]报道10.81%(8/74例)的检出率。本研究各检测年龄组间CMV IgM和CMV感染率差异无统计学意义，但CMV DNA阳性率不完全相同，≤60 d的BA患儿CMV DNA检出率显著>60 d以上患儿，提示对可疑BA患儿出生后早期进行CMV DNA检测有利于提高检出率。另外，CMV DNA与CMV IgM结果一致性较差，提示为提高检出率，可进行CMV DNA与CMV IgM联合检测。本研究中CMV DNA检出组与未检出组或CMV IgM阳性组和阴性组患儿检测年龄差异无统计学意义，不同于Rauschenfels等[13]报道的BA患儿肝组织嗜肝病毒感染检出组平均年龄显著高于未检出组的结论，不支持CMV感染是一种继发感染现象。
另外，Yaghobi等[14]在34例BA新生儿尸检肝组织中未检测到CMV DNA，提示除CMV外，还有其他病毒可能参与BA的发生发展。张锐忠等[11]发现BA肝组织5种嗜肝DNA病毒总检出率为65.9%(56/85例)，认为BA与嗜肝DNA病毒感染密切，但不能证实BA发生与CMV外的其他病毒有关，如患儿血未检出EBV DNA，这与Soomro等[7]报道一致，虽有研究报道BA患儿肝组织EBV DNA检出率为3.53%(3/85例)[10,11]或11.11%(2/18例)[15]，目前，尚不能说明EBV感染参与BA的发生发展。另外，本研究中2例HBs Ag阳性患儿同时有CMV感染，低于文献报道的14.29%(5/35例)[9]，而在33例BA患儿血液[7]和85例肝组织[11]均未检出HBS Ag，34例患儿尸检肝组织中仅3例检出HBV DNA[14]。本研究中HSV IgM阳性率低，肝组织未检出HSV[11]。与已有报道[13,15]类似，本研究中肠道病毒EV RNA仅有1例检出阳性，HAV、HEV、Cox均未检出阳性。
虽然，BA早期诊断和手术治疗可以有效改善患儿预后，但是其临床症状与婴儿肝炎综合征(NHS)非常类似，早期诊断非常困难[16]。有研究应用气相色谱和时间飞行质谱分析血浆代谢组学，发现BA、NHS和健康婴儿组的代谢指纹图能很好地被区分开来[17]。另外，用高效液相色谱-质谱联用技术分析胆汁酸水平及组分的研究发现，BA患者中粪胆酸和鹅去氧胆酸明显降低，可以区分BA和非BA形式的胆汁淤积[18]。因此，临床上有望通过联合检测患儿肝、胆管组织、全血、尿等多种样本中可疑病原体的抗原、抗体或核酸，或运用代谢指纹图或高效液相色谱-质谱联用技术等新检测技术实现对BA患儿早期、精准、快速的诊断，为BA的预防和治疗提供帮助。
