遗传代谢病是由于代谢紊乱导致的一类疾病，临床表型复杂，是儿童致死、致残、致愚的重要原因，绝大多数无有效的治疗手段。通过产前诊断(PND)或胚胎植入前遗传学诊断(PGD)的生殖干预方式，避免患儿的出生，是出生缺陷防控的重要方面。依据遗传代谢病具有代谢异常和基因突变2个基本特点，现阐述PND/PGD技术在代谢遗传病方面的应用，并提出在携带者筛查基础上进行生殖干预的思路。
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人体不断地从外界摄取食物，转变成自己身体的一部分，并贮存能量，同时，也将构成自己身体的一部分物质不断分解并将分解产生的废物排出体外，同时释放能量，这就是通常所说的新陈代谢。代谢异常导致的疾病称为代谢病。遗传代谢病，又称遗传代谢异常或先天代谢缺陷(inborn errors of metabolism，IEM或inherited metabolic disorders，IMD)，是由于基因异常导致的代谢功能缺陷的一大类疾病。自从1908年英国医师Anchibald Garrod发现尿黑酸症并提出"先天性代谢障碍"以及"一个基因一个酶"的概念以来，遗传代谢病的疾病谱越来越大，已发现的超过500种，估计有数千种，占儿童疾病的10%，估计总发生率超过新生儿的0.5%[1,2,3,4]。常见的遗传代谢病有苯丙酮尿症、甲基丙二酸尿症、同型胱氨酸尿症、枫糖尿症、半乳糖血症等。因为遗传代谢病种类多，表型复杂，大多无有效的治疗手段，严重威胁人们的健康，所以，如何避免这类疾病患儿的出生，成为出生缺陷防控的一个重大课题。现试图从产前诊断和植入前诊断的角度，探讨通过生殖干预方式，避免这类疾病患儿出生的方法。
从遗传与代谢的角度考虑，遗传代谢病具有以下特点：(1)遗传代谢病属于单基因病，基因突变是其根本原因，具有家族性、先天性、终生性等遗传病的共性。在遗传方式上，尽管涉及常染色体隐性遗传、X连锁遗传、常染色体显性遗传及线粒体遗传等各种遗传方式，但绝大多数属于常染色体隐性遗传，父母表型正常，且均为杂合子[1,2]。(2)遗传代谢病由于患者的代谢紊乱，导致复杂的临床表型。遗传代谢病涉及各种生化物质在体内的合成、代谢、转运和储存等方面的先天缺陷，包括碳水化合物、氨基酸、有机酸、脂肪酸、内分泌激素、金属离子等代谢紊乱，妊娠期胎儿由于母体提供营养，一般不受影响，出生后发病时间可早可晚，表型异常复杂，常表现为临床所说的疑难杂症。症状多为持续性、进行性，常见的症状包括神经系统异常、代谢性酸中毒和酮症、严重呕吐、肝大或肝功能不全、特殊气味、容貌怪异、皮肤和毛发异常、眼部异常、耳聋等，在新生儿期发病者可表现为急性脑病，造成智力低下、癫痫、脑性瘫痪(脑瘫)甚至昏迷、死亡等严重并发症[3]。(3)绝大多数遗传代谢病目前无有效的治疗手段，避免这类患儿的出生，对于家庭和社会都有重大的意义。虽然少数遗传代谢病可通过饮食、药物、酶补充等方法进行治疗[4,5]，但这些治疗方法都存在治疗费用昂贵、治疗时间漫长等缺点，稍有不慎，患者的智力将会受到不可逆转的损害。例如，苯丙酮尿症如果在症状前发现，可通过低苯丙氨酸的饮食治疗，约90%的患者可像健康人一样生活与就业。但治疗时间长，在成年前需严格限制苯丙氨酸的摄入，成年后才可以稍放宽饮食的限制。除了生活的不便，治疗费用也十分昂贵。因此，寻找有效的生殖干预手段预防遗传代谢病患儿的出生，是出生缺陷防控的重要方面，也是目前以及今后相当长时间内努力的方向。
避免遗传病患儿出生的生殖干预手段，主要包括产前诊断和植入前诊断。预防遗传病患儿出生的前提是及早发现高危妊娠夫妇。目前，有通过先证者发现高危妊娠夫妇以及通过健康人群的携带者筛查发现高危妊娠夫妇2种思路。
先证者是一个家庭中首先被确诊的患者，这些患者一般是由于症状出现后而被医院确诊为遗传代谢病。遗传代谢病的诊断方法包括临床表型诊断、生化诊断、酶活性诊断和基因诊断等。由于遗传代谢病种类多，涉及体内代谢途径广泛，分子病因复杂，不同种类遗传病可表现出相似的临床症状，同一种遗传病又可表现出轻重不同的表型。在临床上，除少数比较特异典型的遗传代谢病可以通过表型诊断为遗传代谢病外，大多数诊断必须通过生化检测或分子诊断等实验室方法确诊。
生化代谢物检测包括血尿常规、肝肾功能、心肌酶谱、血糖、血氨、电解质、钙、磷、酮体、乳酸/丙酮酸、尿酸、血气分析等[6]，如铜蓝蛋白降低提示患者为肝豆状核变性。酶活性测定可得知代谢通路中特定酶蛋白的活性，进行特异性的遗传代谢病的确诊。酶活性检测材料包括血清、红细胞、白细胞、皮肤成纤维细胞、肝组织等。例如，溶酶体贮积症是主要通过酶活性测定进行诊断的疾病，也是溶酶体贮积症分型的重要依据。
当症状出现后再查找病因，对于遗传代谢病患者而言，往往耽误了治疗的最佳时期，因此，在症状出现之前的新生儿期进行遗传代谢病筛查显得尤其重要。近年来，新生儿遗传代谢病筛查发展很快，从1959年Guthrie发明利用细菌生长抑制试验用于苯丙酮尿症的筛查方法发展到了应用串联质谱(tandem mass spertrometry，MS/MS)、气相色谱/质谱(gas chromatography mass spectrometry，GC/MS)以及高效液相色谱质谱联用(liquid chromatography mass spectrometry，LC-MS)的遗传代谢病筛查技术，这些方法往往可同时检测几十种甚至上百种代谢物，可以对患者进行初步的筛查，观察其体内是否存在可能的代谢途径障碍，涉及的疾病种类包括氨基酸代谢疾病、有机酸代谢疾病及脂肪酸代谢疾病等[7]。但体内的生化标志物在遗传与环境共同作用下会有波动，检测会出现一定的假阳性和假阴性，因此筛选出来的疾病进一步通过基因诊断确诊。
当通过对患者的表型诊断或者对新生儿的遗传代谢病筛查，发现出生的婴儿为可疑的遗传代谢病后，就可以通过基因诊断进行遗传学确诊，进而分析夫妻双方是否为携带者，其下一胎是否为高危妊娠。基因诊断是通过DNA的序列分析或者拷贝数变异分析，找出患者特定的遗传改变，是一种特异、灵敏及准确的检测手段，由于基因的改变不受生理状态和环境的影响，而且能够检测出家系中的杂合子携带者，目前，基因诊断已成为遗传代谢病诊断的金标准。
通过先证者检测或者新生儿筛查发现高危妊娠夫妇，只能避免再次妊娠的风险。由于绝大多数的遗传代谢病为隐性遗传，父母都正常，家系调查不能提供线索，如果夫妻双方均为隐性携带者没有及时被检出，他们的第1胎就有生育遗传代谢病患儿的风险。近年来，随着新一代测序技术(next generation sequencing，NGS)的出现，发展了一种扩展性携带者筛查(expanded carrier screening，ECS)的策略。所谓扩展性携带者筛查，就是将一些常见的隐性遗传病基因组合在一起，即特定遗传病的捕获测序技术(panel sequencing)，通过NGS技术，在表型正常的人群中进行隐性遗传病的携带者筛查[8]。NGS可一次性检测个体全部基因序列，具有高通量、低运行成本和高灵敏度等优点。利用NGS技术进行扩展性携带者筛查，当测序数据一定时，每个基因的测序深度很高，可以最大限度地提高检出度。但是，由于选择的是目标基因，有可能漏掉一些极罕见的遗传代谢病。另外，全外显子测序技术(whole exome sequencing，WES)和全基因组测序技术(whole genome sequencing，WGS)2种方式可以检测全部基因，但测序的数据量大，生物信息学分析工作量大。
当确定夫妻双方为某种遗传代谢病的携带者，明确有生育遗传代谢病患儿的高风险时，就可以通过生殖干预避免患儿的出生。所谓生殖干预，就是对有生育遗传代谢病患儿高风险的家庭，通过产前诊断或者植入前诊断的方式，避免出生或者再次出生遗传代谢病的患儿。
产前诊断又称宫内诊断，是对胚胎或胎儿在出生前是否患有某种遗传病或先天畸形作出准确的诊断。针对遗传代谢病，产前诊断使用的遗传分析材料为绒毛、羊水或者脐血。绒毛活检的时期较早，为9～11周；羊水穿刺的最佳时期为16～23周；而脐血检测的时期较晚，为16周以后。检测方法包括代谢产物的分析，酶活性分析以及基因诊断。
在3种取材方式中，羊水取材最为简单，而且取材导致的流产风险最低，是最常用的方法。羊水细胞为胎儿脱落的上皮细胞，可以代表胎儿的遗传物质，经培养后做酶活性测定或基因分析。至今仍然是产前诊断的一个重要手段。
与其他单基因病一般只能通过基因检测进行产前诊断相比，代谢遗传病还可以通过代谢产物进行产前诊断[9]。黏多糖贮积症可检测羊水中的黏多糖，包括硫酸皮肤素、硫酸类肝素、硫酸角质素、硫酸软骨素。使用的方法有单向或双向醋酸纤维薄膜电泳、二甲基美蓝法等。有机酸血症中的甲基丙二酸尿症可用GC/MS检测羊水中甲基丙二酸。
遗传性代谢病中多数为酶缺陷所致，因此，可用经培养的羊水细胞或绒毛测定相应酶活性的方法进行产前诊断。但能够用羊水细胞或绒毛进行产前诊断的疾病并不多，因为很多酶在羊水或者绒毛中不表达。溶酶体贮积症是用酶活性测定方法进行产前诊断最多的一组疾病。产前诊断时要有一份正常标本(羊水或绒毛)做对照，若能有过去保留的阳性标本做阳性对照则更好。值得注意的是，产前诊断中使用代谢产物和酶活性分析，当前一般只是作为辅助诊断，精准的产前诊断还需要通过基因分析。
遗传代谢病属于单基因病，因此，也可以像其他单基因病一样，通过基因分析进行产前诊断。有2种方式进行基因分析：(1)直接分析致病突变，随着DNA序列分析方法的不断进步，直接分析致病基因越来越容易，越来越准确；(2)间接方法，即通过连锁分析等方式，确定胎儿是否遗传了父母双方的风险染色体。
(1)产前诊断的先决条件是对先证者作出准确的诊断或者明确高危妊娠夫妇的基因型，才能对妊娠的胎儿进行明确的遗传学分析。(2)产前诊断时要特别注意避免样品的污染。羊水穿刺时，如果有母血污染，容易导致误诊。但通过羊水细胞培养和换液的步骤，这些污染大多可以排除。绒毛采集后一定要在倒置显微镜下检查挑选。无论是用绒毛、羊水细胞还是用脐血细胞进行检测，首先经过DNA指纹分析，确认无污染时再产前诊断是最保险的方法。
胚胎植入前遗传学诊断(preimplan-tation genetic diagnosis，PGD)是指在胚胎植入母体前完成的遗传学诊断，因为诊断在妊娠之前，所以又称为孕前诊断。与传统产前诊断方式相比，PGD避免了发育异常妊娠后的选择性流产对夫妇造成精神和肉体上的损伤，为遗传病高危妊娠提供了一种新的选择。
PGD的设想是当受精卵发育到6～10个细胞时分离1、2个单卵裂球，或获取卵母细胞的第一极体和第二极体，或者发育到囊胚阶段活检3～5个滋养层细胞，然后，通过遗传学检测技术分析其遗传组成是否正常，仅选择遗传正常的胚胎移植。因为能在体外获得胚胎并能操作胚胎，结合控制性超排卵技术一次可得到多枚胚胎，从而能对胚胎进行遗传选择，所以，体外受精(in vitro fertilization，IVF)是开展PGD的前提。自1990年Handyside等[10]在世界上成功实施第1例PGD以来，PGD技术在最近的20年发展非常迅速。
PGD诊断包括3个基本程序：诊断材料的获取、活检标本处理以及单个细胞的遗传学分析。目前，都需要通过极体/胚胎活检，获得进行遗传学分析的材料。不宜直接分析配子(精子和卵子)的基因，因为配子经过体外分析后无法继续受精。当前有极体(PB)活检、单卵裂球活检及囊胚活检3种方式。PB可间接反映卵母细胞的遗传组成，通过极体分析可检出卵母细胞有无遗传异常。单卵裂球活检(blastomere biopsy)是指当第3天体外受精的胚胎发育到6～10细胞期后，从中取出1、2个卵裂球进行遗传学分析，根据分析结果决定胚胎是否移植。因为活检1、2个卵裂球对胚胎的发育潜能有一定的影响，而且细胞数量少，卵裂期的胚胎嵌合体比例较高，容易导致误诊，所以，单卵裂球活检曾经应用最广，但目前越来越少用于临床。囊胚活检(blastocyst biopsy)是指受精卵培养到囊胚期后，从囊胚的滋养外胚层活检细胞进行遗传学诊断。由于可活检的细胞数目多，活检的细胞无碎片和降解，提高了准确性。当前，囊胚活检已基本取代了其他的活检技术，成为单基因PGD的首选取材方法。胚胎活检的方法包括机械化、化学法及激光打孔法。机械法对操作技术要求较高，目前应用较少。化学法是指用酸性Tyrode消化部分透明带后再用平口针吸取细胞，要求设备较简单，但对活检胚胎的酸化有可能影响胚胎的活性及植入后的进一步发育，目前也已经基本不用。激光打孔方法是目前比较通用的方法，通过产生的激光束正切地指向透明带，依靠透明带测量器在透明带上钻孔取材，具有迅速、简单、安全的特点。囊胚活检，一般采用激光打孔方法。
经过活检获得的细胞，如果用荧光原位杂交(FISH)的技术检测染色体，则需要经过固定的步骤，将细胞固定到玻片上。代谢遗传病属于单基因病，除非是X连锁遗传，需要检测性染色体，一般都是用分子遗传学技术检测某个明确的致病突变。用于分子遗传学检测的活检细胞标本，经过细胞裂解后直接进行PCR扩增或者全基因组扩增，细胞裂解的方法包括碱裂解法和蛋白酶K裂解法。全基因组扩增技术在单基因病的PGD中应用越来越广泛，通过扩增微量细胞的基因组DNA，可以同时检测多个基因，也可以分析染色体的拷贝数变异。全基因组扩增的方法很多，目前常用的有多重置换扩增技术(multiple displacement amplification，MDA)[11]和多次退火环状循环扩增技术(multiple annealing and looping－based amplification cycles，MALBAC)[12]。由于活检会对胚胎造成一定的损伤，近年来也在发展一种非活检的方法进行PGD，即通过分析胚胎培养液中游离的DNA，来间接分析胚胎的遗传组成[13]。这种技术目前前景很大，但尚未应用于临床。
胚胎取样后标本的遗传学分析方法，综合起来可分为代谢水平分析、染色体分析和基因分析等层次。代谢水平分析方法是指检测培养胚胎的培养基中营养物质消耗或代谢产物排出，分析是否有某种代谢水平障碍。但由于早期胚胎许多与遗传性代谢性疾病有关的酶基因尚未表达，限制了代谢水平分析方法在PGD中的应用。对于遗传代谢病而言，主要应用基因分析来评估胚胎是否携带致病的基因突变。有多种分析活检胚胎的遗传学分析技术，这些技术主要以PCR技术为基础。
PGD中的PCR技术，是单细胞水平的PCR技术[14]。巢式PCR和多重PCR是2种主要的检测技术。巢式PCR是通过"内""外"2对引物，先用外引物进行大片段产物的扩增，然后以大片段产物为模板，用内引物对进行小片段产物的特异性扩增的方法。该法的敏感性、特异性均较常规单次PCR高。多重PCR是指在一次PCR反应中针对基因组中的多个位点采用不相关的多对引物同时进行扩增，再结合巢式PCR技术针对目的基因分别进行内扩增或结合荧光PCR自动测序技术可快速有效地得到诊断结果。其他的单细胞PCR技术还包括荧光PCR、反转录PCR(RT-PCR)和一步PCR扩增法等。荧光PCR敏感性比常规PCR要高1 000倍，循环次数大大低于巢式PCR。其还有效地避免等位基因的偏性扩增，且等位基因丢失的发生率也大大降低。反转录PCR将致病基因表达的mRNA反转录成cDNA，再对cDNA进行扩增，从而进一步检测目的基因有无异常。一步PCR扩增法采用减少巯基形成的试剂(β-巯基乙醇)和相对高的离子强度溶液，只经一次PCR扩增即可达到能经聚丙烯酰胺凝胶检测的产物量，而无需像荧光PCR法需标记荧光引物和自动测序装置，这是一种经济适用、有较大应用前景的PGD技术。
细胞数量太少是制约PGD发展的一个主要因素，标本处理过程中极易丢失，全基因组扩增技术可降低这一风险。由于受到活检细胞DNA含量极微的限制，单基因病PGD还存在因等位基因脱失及污染导致误诊的风险。等位基因脱失(allele dropout，ADO)是指2个等位基因只能扩增出1个，另1个等位基因没有扩增成功或扩增的数量有限，达不到诊断的水平，ADO的发生率为5%～20%，是导致误诊的主要原因。用多重PCR方法扩增致病基因及其紧密连锁的多态片段、改进标本处理方法、使用热启动PCR、良好的引物设计、严格的操作等措施，均可降低ADO而减少误诊。透明带内残余的精子及母体的丘细胞污染也是导致误诊的重要因素。前者可用单精子胞质注射的方法避免。避免丘细胞的污染，除了操作中尽量去除丘细胞并在倒置镜下检查证实外，活检卵裂球还应在PBS或培养基中反复洗脱。外源DNA污染比较容易控制，主要需要严格控制实验试剂以及工作环境。
近年来，在单基因病PGD中普遍使用连锁标记以减少ADO率，理论上，如果针对致病基因的突变位点进行PGD检测，即使有20%的ADO率，当同时增加一个连锁位点时，同时发生ADO率的风险为20%×20%＝4%，如果再增加一个连锁位点，则3个位点同时发生ADO率的风险降低到8/1 000。可见，在PGD中找到有效的连锁标记，可以显著地降低ADO率，提高准确性。
例1：一个曾生育过遗传代谢病患儿的家庭再生育时的PGD方案。2014年来自湖南衡阳的一对夫妇来中信湘雅生殖与遗传专科医院遗传咨询门诊就诊。他们的第1个孩子刚出生时正常，4个月时发现运动和发育落后，头发变黄，尿液有鼠臭味，就诊时患儿已3岁，智力明显落后。经湖南省儿童医院确诊为苯丙酮尿症患儿，来中信湘雅生殖与遗传专科医院寻求生育1个健康孩子。根据其临床特征，对患儿及其父母进行了基因诊断，结果提示患儿PTS基因存在c.286G>A(p.Asp96Asn)和c.331G>A(p.Ala111Thr)复合杂合突变，该夫妇分别为PTS基因c.286G>A和c．331G>A突变的携带者。根据基因检测的结果，这对夫妇再次遗传咨询时，要求通过PGD方式助孕。获卵16枚，卵泡浆内单位精子显微注射后有14枚受精，9枚发育到囊胚。采用激光打孔的方法对这9个囊胚进行活检，随后进行全基因组扩增。选取与该夫妇紧密连锁的4个STR位点作为连锁标记，通过联合目的突变直接检测和连锁分析的方法对9个胚胎进行了遗传学诊断，结果显示2个胚胎为完全正常胚胎，3个胚胎为携带者胚胎，4个胚胎为患者。经第3次遗传咨询，患者同意移植1枚完全正常的优质胚胎，获得成功，孕18周时羊水穿刺进行产前诊断，于2016年1月生育一基因型健康婴儿，1岁时随诊，发育良好。
例2：一个通过扩展性携带者筛查发现夫妻均为同携带隐性致病基因的PGD方案。2014年来自深圳的一对夫妇来中信湘雅生殖与遗传专科医院进行遗传咨询，要求PGD助孕。双方初婚，既往未曾妊娠与生育。他们了解到可以对常见遗传病进行筛查，而在一家测序公司进行了常见遗传病的携带者筛查检测，结果显示双方EVC1基因均存在c.1702C>T(p.Gln568Term)杂合致病突变，均为软骨外胚层发育不全携带者，若生育则为高危妊娠。根据其在外院的检测结果，验证这对夫妻同时携带EVC1基因的致病性突变，并在该基因的上下游找到5个紧密连锁STR标记。经过中信湘雅生殖与遗传专科医院的病例讨论，同意对这对没有先证者的夫妇实施PGD助孕。经体外受精及囊胚培养，有7枚胚胎发育到囊胚，采用激光打孔的方法进行活检，随后进行全基因组扩增。采用联合目的突变直接检测和连锁分析的方法进行遗传学诊断，结果显示这7枚囊胚中，2个胚胎为完全正常胚胎，3个胚胎为携带者胚胎，2个胚胎为致病的纯合突变风险胚胎。随后移植了1个完全正常胚胎，于2016年12月生育一健康女婴。
总的来说，遗传代谢病是一类非常复杂的疾病，通过产前诊断或者植入前遗传学诊断是有效的生殖干预措施。为降低遗传代谢病患儿的出生，提出在遗传咨询和充分的知情同意为基础，结合新生儿筛查和对将来健康人群携带者携查的生殖干预方案见图1。
Program of reproductive intervention based on neonatal screening and expanded carrier screening
Program of reproductive intervention based on neonatal screening and expanded carrier screening
