罕见病是人群中发病人数少或发病率低的疾病的总称。美国将患病人数不超过20万的疾病归类于罕见病^[1]，日本对罕见病的定义是发病率低于1/2 500或患病人数不超过5万例的疾病^[1]，世界卫生组织对罕见病的定义是发病率不超过1/1 000^[2]，中华医学会遗传学分会将罕见病定义为发病率低于1/500 000或新生儿发病率不超过1/10 000的疾病^[3]。尽管单病种发病率低，但作为一类疾病罕见病并不少见。据估算，欧洲罕见病患者占总人口的6%～8%^[4]，欧美罕见病患者约为3 000万^[3,4]，我国罕见病患者的总数也在1 000万以上^[5]。目前已知的罕见病病种超过7 000^[6]，由基因改变引起的遗传性罕见病占80%左右^[7]，其中儿童占60%以上^[3]。

遗传性罕见病的致病原因包括染色体数目和结构异常、基因拷贝数改变及DNA序列变异等。罕见病的诊断是临床上的难点，不少罕见病患者因未能得到及时的诊断而延误病情^[8,9]。临床检查、病史及家族史采集在诊断遗传性罕见病中起重要作用，不仅能建立初步的临床诊断，也可指导实验室检查。

实验室基因检测方法有多种，常用的有染色体核型分析(karyotyping)、荧光原位杂交(FISH)、PCR和一代(Sanger)测序等。核型分析检测染色体数目和结构异常，分辨率不超过8～10 Mb，适用于诊断染色体改变引起的罕见病，如范可尼贫血(Fanconi anemia，FA)。FA临床表现为身材矮小、四肢末端畸形、生长发育迟缓、骨髓衰竭等。诊断FA的金标准是分析染色体的断裂(chromosome breakage)和结构异常，然后用测序方法分析15个FA基因对FA进行分型。染色体检查的不足是分辨率不高，不能发现基因微小结构改变，技术要求高，并带有一定的主观性。FISH适用于分析基因片段的改变，分辨率为50～100 kb，明显优于染色体分析，是诊断微小基因片段改变引起的遗传性罕见病的有效手段。威廉姆斯综合征(williams syndrome，WS)是由第7号染色体长臂7q11.23位点的微小片段(1.5 Mb)缺失所致，FISH能快速准确地检测出微小缺失做出分子诊断^[10]。引起先天性心脏畸形的DiGeorge Syndrome，由于第22号染色体长臂上22q11.21含有TBX1基因的微小片段(1.5～3 Mb)缺失所致，FISH是确诊此病的首选方法^[11]。FISH的不足是不能同时检测众多基因位点，不能发现检测位点外的基因改变。PCR和Sanger测序检测DNA序列改变，包括点突变、微小DNA片段缺失和插入等，适用于分子诊断单基因改变的遗传性罕见病，如苯丙酮尿症(PKU)。PKU是苯丙酸羟化酶基因PAH改变所致的单基因遗传性罕见病，Sanger测序能检测出PAH基因改变，做PKU的分子诊断^[12]。常规基因检测技术目前仍是实验室诊断遗传性罕见病的主要方法。

近10多年来随着分子生物学技术的发展，以二代测序和染色体基因芯片为代表的高通量基因组检测技术正快速被应用于分子诊断遗传性罕见病^[13]。染色体基因芯片分析全基因组范围内基因拷贝数改变(缺失和扩增)，分辨率达50～100 kb，还能发现基因组杂合性缺失区域，在检测通量和灵敏度上均优于染色体检查和FISH，是分子诊断基因拷贝数改变引起的罕见病的有效技术。国内外许多专业协会建议将染色体基因芯片作为分子诊断自闭症、智力障碍和出生缺陷的首选方法。该方法不足之处是不能发现平衡易位和倒置结构性改变。

二代测序具有高通量反复多次测序的特征，以其为基础的检测平台有基因突变热点系列套餐、疾病基因系列套餐、外显子组测序和全基因组测序。基因突变热点系列套餐集中检测致病基因的突变高发区域，可包括几十至上百个基因突变热点区域，方法简单、费用相对较低、生物信息分析工作量不大。疾病基因系列套餐分析几十至几百个与同一疾病或临床症状有关的基因。如先天性心肌病基因系列套餐检测50～70个与心肌病有关的基因，线粒体病基因系列套餐分析40～450个与线粒体病有关的基因，眼病基因系列套餐检测66～140个眼病基因。疾病基因系列套餐检测有关疾病基因的全部外显子，阳性率较基因突变热点系列套餐高，生物信息工作量不是太大，是目前临床上应用最多的二代测序检测套餐。

许多遗传性罕见病缺乏特征性的临床症状，凭借临床表现难以做出临床诊断，很难选择适当的疾病基因系列与套餐进行分子诊断。如很多疾病可表现为智力发育障碍，然而目前已知智力发育障碍有关的基因达700多个，尚无合适的疾病基因系列套餐。还有不少尚未认知的罕见病，仅检测已知的致病基因就有可能漏诊此类疾病。外显子组测序分析基因组内的所有基因，是分子诊断遗传特征不明确的罕见病的有效手段。外显子组测序平台有医学外显子组测序和全外显子组测序(WES)。医学外显子组测序分析目前已知的4 500个疾病基因，生物信息分析工作量是WES的30%左右，该方法适用于常见的遗传性罕见病的分子诊断，但该方法仅检测已知的致病基因，不能发现和分子诊断由新的疾病基因所致的罕见病。

WES分析全基因组的基因，分子诊断阳性率高于医学外显子组测序。虽然WES方法具有高通量、单基因检测成本低的优点，但该方法不能有效地分析某些特殊DNA序列，如脆性X染色体的CGG重复片段。二代测序的瓶颈是生物信息分析测序数据^[14]。每项WES能检测出2万～10万序列改变，但是其中大多数是中性改变，往往只有几个是发病有关的病理改变^[15]。从上万个序列改变中鉴别出几个致病性改变犹如大海捞针，不仅工作量大，还需运用计算机、生物统计、医学、遗传学等多邻域的技术和知识。目前常用的简化生物信息分析的方法是Trios检测，即同时检测患者和父母3人的外显子组，比较父母与患者的测序结果，排除同时存在于父母和患儿的非病理性改变^[15]，大大缩小候选致病性基因改变的数目。另一方法是先集中分析与患者临床症状直接有关的基因，如患者呈现智力发育障碍和心脏疾病，则先分析与这些症状有关的基因，若分析结果阴性，再扩大到其他基因，用临床症状协助生物信息分析^[15]。比较各基因诊断方法的阳性诊断率，染色体分析阳性率为5%～10%，染色体基因芯片阳性率为15%～20%，Sanger测序阳性率为5%～15%，WES阳性率为25%～30%^[16,17]。

随着测序成本的不断降低，全基因组测序已开始用于罕见病的分子诊断，该方法分析基因组全部DNA，是最全面的基因组检测平台。但全基因组测序的后期测序数据的生物信息分析量非常庞大，而且往往同一区域内重复测序次数低于外显子组测序(30×比100×)，因此，全基因组测序在准确性和敏感度上都低于外显子组测序；另外全基因组检测耗时长，费用昂贵，限制了全基因组测序在临床上的广泛应用。

尽管近年来新的分子基因检测技术在分子诊断罕见病中发挥越来越大的作用，临床检查、病史和家族史采集仍在罕见病的诊断中占有非常重要的地位。临床资料有助于确定罕见病的遗传特征(显性、隐性或X-连锁遗传)，得出初步临床诊断，指导有针对性地选择实验室检测方法。不同专科集体会诊在罕见病的诊断中非常重要。

正确选择检测方法，不仅可以降低检测费用，更主要的是患者得以及时的诊断和治疗。仔细的临床检查和熟悉各检测方法的特点是合理选择基因检测项目的前提。若临床检查提示唐氏综合征，选用常规染色体检查就能做出诊断；而怀疑Williams综合征的患儿应选用FISH检测。许多单基因改变引起的罕见病用一代测序就可以得到分子诊断。若患者呈现智力发育低下或自闭症症状，仅凭临床表现不能将其与某一特定的疾病相联系，可考虑选择染色体基因芯片检测基因拷贝数目改变，若检测结果阴性，可考虑WES。

选择不同检测机构提供的二代测序项目时，首先要了解项目所检测的疾病基因系列套餐，不同机构可能检测的基因数目不同，如同样的耳聋基因系列套餐，有的机构检测20个基因，有的检测70多个基因；还有癫痫基因系列套餐，有的检测50个基因，有的检测130个基因。即使检测相同的基因，有的机构分析基因突变热点区域，有的分析基因全部外显子，很明显后者的分子诊断率高于前者。

越来越多的检测机构开始提供外显子组检测项目，但有的实验室提供医学外显子测序，分析4 500个已知致病基因改变；有的实验室提供WES，分析13 000多个基因。虽然医学外显子测序能诊断大多数遗传性罕见病，但难免遗漏一些新的罕见病。此外二代测序结果的假阳性率高于一代测序，有必要了解检测机构是否对二代测序结果用第2种方法进行验证，以确保检测结果的准确性。有许多检测机构对二代测序结果不做验证，对这些检测结果应谨慎。

迄今为止仍没有判断序列改变致病性的统一标准和方法，不同的检测机构采用不同的标准和方法来判断测序结果，这往往是导致不同实验室对同一标本得出不同检测结果的原因之一。许多检测机构缺乏患儿的临床信息，不能结合临床对检测结果做正确的解读。有的实验室将检测到的全部序列改变列在检测报告中，而有的仅将其判断为病理性的改变列在报告中。临床医师在选择检测机构时要充分了解检测项目的内容、检测技术、如何报告检测结果、是否结合临床表现解读检测结果等，从而合理选择检测机构和检测项目，提高罕见病分子诊断的阳性率。

我国是罕见病大国，主要的罕见病诊治机构集中在大城市，中小城市和农村罕见病患者往往得不到及时诊治，错过最佳的治疗时机，有的出现后遗症甚至危及生命。临床医学遗传学还未被列为临床专科，缺乏培养临床遗传专科医师的体系，掌握现代分子基因诊断技术的人员不多，许多基因检测报告对临床的指导意义不大，影响罕见病的分子诊断水平。

近年来，我国对罕见病的重视程度不断提高，在罕见病基础研究和分子诊断技术方面取得了可喜的进展，基因组检测技术已运用于罕见病的诊断中。上海市在2016年初发布了《上海市主要罕见病名录》，列举了56种遗传性罕见病。专业人才培训和行业标准化方面也在不断地完善，有望在不久的将来建成我国人群基因信息库，提高诊断我国人群罕见病的能力。随着具有我国自主知识产权基因诊断技术的不断出台和推广，分子基因检测费用将进一步降低。相信在不久的将来，我国在罕见病的分子诊断方面将达到国际先进水平。