既往对百日咳特异性免疫应答的研究主要集中于B淋巴细胞介导的体液免疫，近年来越来越多的研究表明，CD4＋ T淋巴细胞介导的细胞免疫在清除百日咳感染中至关重要。CD4＋ T淋巴细胞根据分泌细胞因子的不同，可分化为辅助性T淋巴细胞(Th)1、Th2及Th17等不同T淋巴细胞亚群。动物实验证实百日咳杆菌的彻底清除需要Th1与Th17反应。动物实验与人类的研究结果均表明，自然感染和全细胞百日咳(wP)疫苗可诱导Th1与Th17介导的免疫反应，而无细胞百日咳(aP)疫苗诱导Th2和Th17介导的免疫反应。这种免疫反应的差异可能是wP疫苗转变为aP疫苗后百日咳再现的重要原因之一。
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20世纪40至50年代开始推广使用全细胞百日咳(whole cell pertussis，wP)疫苗以后，百日咳发病率在全球范围内大幅下降[1,2]。20世纪90年代开始，wP疫苗逐渐被更为安全的无细胞百日咳(acellular pertussis，aP)疫苗取代。此后，一些疫苗覆盖率高的发达国家，如美国、以色列、澳大利亚、英国等，流行病学监测发现百日咳发病率逐渐升高，称为"百日咳再现"(pertussis resurgence)[3,4,5]。研究提示aP疫苗诱导的保护性免疫存在缺陷，不能诱导类似于自然感染后的细胞免疫反应是百日咳再现的重要原因之一[6,7,8]。现对百日咳自然感染和疫苗诱导细胞免疫反应的有关研究进行综述，加深对百日咳发病和疫苗免疫保护机制的认识。
既往认为百日咳杆菌是完全的胞外感染菌，因此，对百日咳感染的研究主要集中于体液免疫应答。但百日咳杆菌感染T淋巴细胞缺陷裸鼠可导致持续甚至致死性的感染，而过继转移免疫鼠脾脏细胞尤其是CD4＋ T淋巴细胞可促进其清除病原体，确证了CD4＋ T淋巴细胞在百日咳免疫中具有重要作用[9]。
CD4＋ T淋巴细胞根据分泌细胞因子的不同，可分化为辅助性T淋巴细胞(Th)1、Th2及Th17等不同T淋巴细胞亚群。有研究表明，百日咳感染鼠的抗原特异性CD4＋ T淋巴细胞主要分泌干扰素(IFN)－γ和/或白细胞介素(IL)－17，而无IL－4和IL－5[9]。多种细胞因子或受体缺陷小鼠用于研究CD4＋ T淋巴细胞在抗百日咳杆菌感染中的作用机制。与野生型(wild type，WT)小鼠相比，尽管IL－4－/－小鼠存在Th2细胞分化缺陷，但其清除百日咳杆菌的能力与WT无明显差异[10]。然而，IFN－γ－/－及IFN－γ受体(IFNγR)－/－小鼠与WT相比，其清除百日咳杆菌能力显著下降。临床上百日咳感染仅限于呼吸道局部，并不扩散，但部分IFNγR－/－小鼠可发生致死的扩散性感染，进一步证明了Th1细胞在抗百日咳感染中具有关键作用[9]。IL－17A－/－小鼠在呼吸道感染百日咳杆菌后6周不能清除病原体，说明了Th17在抗百日咳感染中也具有重要作用[11]。
既往小鼠等动物模型不能完全复制人类百日咳的临床表现(以咳嗽为例)。而与小鼠模型相比，狒狒可以发生持续2周以上的严重咳嗽。研究发现，感染百日咳的狒狒鼻腔灌洗液中Th17相关细胞因子水平显著增高，感染后5 d IL－17水平增加至感染前的7倍，IL－6水平增加50倍左右。收集感染后恢复2年的动物外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)，百日咳杆菌体外刺激仍能检测到特异性Th1与Th17反应[12]。
基于人类感染病例的研究也提示百日咳自然感染主要诱导Th1与Th17反应。Ryan等[13]收集2～23、24～48、49～96月龄的百日咳急性感染期、恢复期和无百日咳病史的未免疫儿童的PBMC，百日咳抗原刺激后，各年龄段的急性感染与恢复期儿童PBMC中T淋巴细胞增殖反应均显著高于对照组儿童，且主要分泌IFN－γ而无IL－5，随后大量研究验证了上述结果。百日咳感染诱导人类Th17反应的证据主要来自于体外细胞试验[11]，健康人外周血单核细胞来源的树突状细胞(human monocyte derived dendritic cells，MDDC)进行百日咳抗原刺激后，MMDC分泌的IL－6、IL－1β、IL－23和IL－12显著增加，将刺激过的MMDC与纯化的T淋巴细胞共培养，Th17与Th1的分化显著增加。
与自然感染相似，wP疫苗主要诱导Th1/Th17反应。对wP疫苗免疫过的小鼠脾脏细胞或分离建立的T淋巴细胞系进行抗原刺激，均检测到高水平的IFN－γ和IL－2，而无IL－4和IL－5。此外，wP疫苗主要诱导免疫球蛋白G(IgG)2a/b/c产生，也提示发生的为Th1反应[14]。Higgins等[15]通过Toll样受体(Toll－like receport，TLR)4缺失的C3H/HeJ小鼠和正常C3H/HeJ小鼠研究TLR4在疫苗诱导的百日咳适应性免疫应答中的作用时发现，wP疫苗免疫过的小鼠脾脏再次接受百日咳杆菌刺激时可分泌高水平的IFN－γ与IL－17，且动物实验证实IL－17可减弱wP疫苗的保护作用。C3H/HeJ小鼠中wP疫苗保护作用的失败与显著下降的IL－17水平也说明，wP疫苗可通过诱导Th17反应发挥保护作用。对IFN－γ－/－小鼠进行wP疫苗免疫后，尽管IL－17水平显著增加，但细菌清除能力仍显著低于WT对照组。而对IL－17A－/－小鼠进行wP疫苗免疫后，细菌清除能力与WT对照一致且IFN－γ水平显著增加，进一步说明wP主要通过Th1反应发挥保护作用，Th17反应的作用弱于Th1反应。
狒狒百日咳模型中wP疫苗主要诱导Th17/Th1反应。狒狒出生后的2、4、6个月接种wP疫苗，免疫完成1个月后收集PBMC体外进行抗原刺激，PBMC中未贴壁细胞及分离纯化的CD4＋ T淋巴细胞均分泌高水平的IL－17和一定水平IFN－γ[16]。体内实验wP疫苗免疫可加快百日咳感染清除的结果，进一步印证了Th1和Th17在百日咳感染中的保护作用。但与之前实验结果略有不同的是，在该模型中Th1反应相对较弱，作者认为可能与不同厂商来源疫苗的异质性有关，仍需进一步验证。
人群研究结果也证明了wP疫苗诱导的主要是Th1/Th17反应。Ausiello等[17]收集wP疫苗基础免疫1个月后7月龄婴儿的PBMC，使用百日咳抗原刺激后，IFN－γ水平显著升高，而IL－5水平极低，甚至无明显分泌。后续大量类似的研究获得相近结果。Schure等[18]采集在2、3、4及11个月时进行wP疫苗免疫的4岁儿童的PBMC，百日咳抗原刺激后，检测到一定水平的IL－17分泌，提供了wP疫苗免疫诱导Th17反应的临床数据。
由于接种wP疫苗可能出现脑病等严重不良反应，1990年起逐渐被更为安全的aP疫苗替代。与wP疫苗含3 000种以上的抗原成分相比，aP疫苗一般由1～5种百日咳杆菌抗原成分构成，包括百日咳毒素(pertussis toxin，PTX)、丝状血凝素(filamentous hemagglutinin，FHA)、百日咳杆菌黏附素(pertacin，PRN)、菌毛蛋白2(fimbriae 2，FIM2)和菌毛蛋白3(fimbriae 3，FIM3)，但剂量非常高[3,19]。
与自然感染和wP疫苗免疫不同，aP疫苗免疫主要诱导Th2/Th17反应。早期研究证明，aP疫苗免疫小鼠脾脏分泌高水平IL－5、IL－4而无IFN－γ，即典型Th2反应。aP疫苗在小鼠体内诱导的IgG1型抗体产生，说明引起的是Th2反应[9]。与aP疫苗免疫的WT－/－小鼠相比，aP免疫的IL－17A－/－小鼠细菌清除速度显著降低，证明了Th17反应在aP疫苗免疫中的重要保护作用。与wP免疫诱导反应方向的不同似乎也影响了保护性免疫的质量[10]，wP免疫小鼠再次感染后5～7 d即可清除病原体，而aP免疫小鼠清除速度显著慢于wP免疫小鼠，需要10 d左右。
在狒狒百日咳模型中，aP疫苗免疫未诱导明显的Th17反应，而是Th2/Th1反应。尽管aP免疫狒狒与wP免疫狒狒在感染早期的细菌定植无明显差异，但aP免疫狒狒的病原体清除能力同样弱于wP免疫狒狒。将aP疫苗免疫狒狒、未免疫对照与感染百日咳的狒狒进行同笼饲养，7～10 d后所有动物鼻腔灌洗液中均可检测到细菌定植。此外，将感染百日咳的aP疫苗免疫狒狒与正常狒狒同笼饲养，可传染同笼动物[16]。因此，有学者认为，aP疫苗无法防止定植和传播，这可能是高疫苗覆盖率国家百日咳复现的原因之一。
基于人群的研究也显示，aP疫苗免疫主要诱导Th2和Th17的混合反应[10]。aP疫苗加强免疫甚至可以使wP疫苗诱导的Th1反应向Th2/Th1方向转化。Ryan等[20]对2、3及4个月时接种过wP疫苗的4岁儿童进行aP加强免疫，1个月后收集PBMC进行百日咳全菌或纯化抗原刺激，未进行aP加强免疫儿童PBMC仅分泌IFN－γ而无IL－5，而aP加强免疫儿童PBMC可产生一定水平的IL－5，使Th1反应向Th2/Th1方向转化。但与上述结果不同，Bancroft等[21]检测抗原特异性IFN－γ/IL－5阳性细胞比例发现，aP加强免疫0.5～3.0个月后并不会改变或加强wP或aP疫苗的免疫反应类型。aP免疫是否加强Th2反应的不同结果可能与不同的实验设计有关，早期研究主要对同一研究对象免疫前后进行比较，后期研究主要针对加强和未加强免疫人群的反应进行比较[22]。肯定一致的结论是wP疫苗免疫主要诱导Th1反应，aP疫苗主要诱导Th2反应。
综上所述，百日咳自然感染与疫苗诱导的细胞免疫反应存在差异。自然感染和wP疫苗可诱导Th1与Th17介导的免疫反应，而aP疫苗诱导的是Th2和Th17免疫反应，这可能是wP疫苗转变为aP疫苗后百日咳再现的重要原因之一。随着狒狒百日咳模型的出现及实验，对疫苗诱导细胞免疫反应的不同及疫苗效力评估将不断深入。优化疫苗是预防百日咳再现进一步恶化的重要措施之一。疫苗研发者需要考虑是否可以在现有的无细胞疫苗基础上，添加促进Th1反应的佐剂，如TLR激动剂的使用[23,24]，或研发新的aP疫苗[25]，并在狒狒模型中进行全面系统地评估。
