儿童急性淋巴细胞白血病(ALL)是一种起源于淋巴细胞异常增生的恶性肿瘤性疾病，是儿童最常见的恶性肿瘤。虽然分层治疗已使儿童ALL的疗效明显提高，但仍有15%～20%的患儿最终复发，其主要原因是白血病微小残留病变(MRD)的存在。MRD是指白血病患者经诱导化疗完全缓解后(或骨髓移植后)，在体内残存有形态学上不能检测到的微量白血病细胞的状态。MRD的检测方法主要有流式细胞术和实时荧光定量聚合酶链反应及免疫组库测序技术。检测MRD水平对判断预后、指导危险度分组及个体化治疗等方面具有重要意义。现总结近年来儿童ALL－MRD的主要检测方法及临床应用所取得的进展。
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儿童急性淋巴细胞白血病(ALL)是一种起源于淋巴细胞异常增生的恶性肿瘤性疾病，是儿童最常见的恶性肿瘤，其发病率有逐年增高的趋势。虽然分层治疗使其疗效得到明显提高，5年无事件生存率(EFS)已达80%，但仍有15%～20%的患儿复发，复发是患儿获得长期生存的主要障碍，也是目前白血病治疗的最大难题[1,2,3]，其主要原因是白血病微小残留病变(MRD)的存在[4]。MRD是指白血病患者经诱导化疗完全缓解后(或骨髓移植后)，在体内残存有形态学上不能检测到的微量白血病细胞的状态。因此，采用灵敏度高、特异性强、经济方便的检测方法对MRD进行动态监测，对评估早期治疗反应、危险度分层、判断预后、指导ALL复发患者和个体化治疗显得尤为重要[5]。现就近年来儿童ALL－MRD的主要检测方法及其临床应用所取得的进展进行综述。
目前公认最有效的MRD检测方法是实时荧光定量PCR(qPCR)和多参数流式细胞术(MFC)，这2种方法的主要特点见表1[5,6,7,8]，而基于新一代测序技术(NGS)发展起来的免疫组库测序技术(IR－SEQ)在ALL－MRD检测上也有其独特的优势。
急性淋巴细胞白血病－微小残留病常用检测方法的特点
Features of acute lymphoblastic leukemia－minimal residual disease detection methods
急性淋巴细胞白血病－微小残留病常用检测方法的特点
Features of acute lymphoblastic leukemia－minimal residual disease detection methods
| 项目 | FCM检测白血病异常免疫表型 | qPCR检测Ig/TCR基因重排 | qPCR检测融合基因转录本 |
|---|---|---|---|
| 灵敏度 | 3～4色：10－3～10－4；6～8色：10－4；≥8色：10－4～10－5 | 10－4 ～10－5 | 10－4～10－6 |
| 适用性 | B－ALL：>90%；T－ALL：>90% | B－ALL：>95%；T－ALL：>95% | B－ALL：25%～40%；T－ALL：10%～15% |
| 优点 | 快速，适用性强，可早期行MRD定量分析，可获得肿瘤细胞的其他信息 | 灵敏度高，适用性强，标准化程度高，DNA稳定 | 灵敏度高，方法简单、快速，靶基因稳定，适用于特定亚型的白血病(BCR－ABL、MLL－AF4等) |
| 缺点 | 3～4色FCM灵敏度低，免疫表型转换，相对较昂贵，标准化有限 | 成本高，需具备丰富的经验和知识，筛选标志费时，克隆演变致假阴性 | 适用性有限，表达水平存在差异，PCR污染致假阳性，稳定性差，标准化有限 |
注：FCM：流式细胞术；qPCR：实时荧光定量聚合酶链反应；Ig：免疫球蛋白；TCR：T淋巴细胞受体；B－ALL：急性B细胞型淋巴细胞白血病；T－ALL：急性T细胞型淋巴细胞白血病；MRD：微小残留病 FCM：flow cytometry; qPCR：quantitative real－time polymerase chain reaction；Ig：immunoglobulin；TCR：T－cell receptor；B－ALL：B－cell acute lymphoblastic leukemia；T－ALL：T－cell acute lymphoblastic leukemia；MRD：minimal residual disease
FCM检测ALL－MRD的基本原理是通过多参数定量分析白血病相关免疫表型(LAIPs)，从而与正常和再生的骨髓细胞区分，灵敏度可达10－5。LAIPs主要有3类：第1类是幼稚T淋巴细胞免疫表型，常用的有末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)、CD3等[9]；第2类是异常前体B淋巴细胞免疫表型，常用的有CD19/CD34/CD10/CD58等[9]；第3类是融合基因表达的融合蛋白，目前尚缺乏相应的FCM检测抗体，但研究表明一些新发现并用于MRD检测的CD分子与融合蛋白的表达相关[10]。因为LAIPs具有跨系抗原表达、抗原表达不同步、抗原表达增强或减少等特点[9]，所以建议使用多重抗体组合检测LAIPs，以避免免疫表型转换引起的假阴性结果[5]。
MFC是目前常用的方法，研究发现标准的8色FCM更适合儿童ALL－MRD检测，可最大限度地减少免疫调节治疗的负面影响，并增加分析的灵敏度[8]。
qPCR是指在PCR反应体系中加入荧光基团，在指数扩增期通过连续监测荧光信号出现的先后顺序及强弱变化实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对模板进行定量分析，没有额外的PCR后处理及相关污染的风险，灵敏度可达10－6。通常选用免疫球蛋白(Ig)/T淋巴细胞受体(TCR)基因重排序列或融合基因作为基因标志，将ALL细胞与正常细胞进行区分。
Ig/TCR基因重排产生的V－(D)－J结合部序列具有白血病克隆特异性，在不同亚型的ALL患儿中发生率和稳定性不一致[5]。虽然该方法灵敏度、特异变均很高，但其需要设计特异性引物，筛选费时，并且Ig/TCR重排存在克隆演变和寡克隆等现象，可造成假阴性结果。因此，为了取得更好的检测精度，推荐对患者使用至少2种Ig/TCR靶分子进行MRD检测[11]。
融合基因是染色体易位形成的具有特异性的白血病分子标志，是检测MRD的良好指标。qPCR可对含融合基因的白血病亚型进行精确检测，但仅对40%左右的ALL患者适用。常见的融合基因有TEL/AML1(即ETV6－RUNX1)、E2A/PBX1、BCR/ABL以及AF4/MLL[12]。虽然该方法具有特异性强、灵敏度高等优点，但仅适用于特定亚型的白血病，并且融合基因表达水平存在差异，PCR污染可致假阳性以及难以对白血病细胞数定量。
MRD水平不但有助于评估早期治疗反应、进行危险度分组，而且有助于判断预后、预测复发，还有助于指导造血干细胞移植、复发ALL患者治疗及个体化治疗。
目前国际上大多试验组都采用MRD水平来评估早期治疗反应，并进行精确的危险度分组和治疗强度分层[5]。Campana[15]根据St.Jude儿童医院的第ⅩⅥ号方案，以治疗的第15天和第42天骨髓中MRD水平进行危险度分组、治疗分层及调整分组：第15天，MRD≥10－2的患儿接受强化治疗，MRD≥0.05则接受进一步强化治疗，MRD≤10－4的患儿接受较轻的再诱导治疗(减少蒽环类药物的总剂量)。如果标危组ALL患儿在第42天MRD≥10－4，则调整为高危组；而第42天MRD≥10－2的患者则在第1次完全缓解时考虑行造血干细胞移植。Pui等[16]将第19天MRD≥10－2或第46天MRD 10－4～10－3归为标危组，在诱导缓解末MRD≥10－2或继续治疗7周后MRD≥10－3归为高危组，其余的则为低危组。研究显示在第19天MRD≥10－2的患者即使接受强化治疗，其总体预后也较差，10年EFS为64.1%(MRD低水平或未检出者为90.7%)。在第46天MRD转为阴性(<10－4)以及在第19天临时划分的低危患者，10年EFS为88.9%，而在第46天检出MRD的患儿10年EFS仅为59.2%。也有研究显示MRD水平联合CpG岛甲基化表型进行危险度分组可能是未来的发展方向，并能在治疗决策中提供重要的信息[17]。
MRD是儿童ALL最强的独立预后因素，也是预测复发的敏感指标。不同的ALL亚型和检测时间点，MRD水平对判断预后和预测复发的意义不同。Gandemer等[18]研究显示，完全缓解(CR)后MRD≥10－3和MRD<10－3患者5年累积复发率分别为43.6%和16.7%。Pui等[19]研究显示，含ETV6－RUNX1融合基因或超二倍体>50的ALL预后是最好的，在第19天MRD<10－4的患者复发风险低，但高危的B－ALL或T－ALL患者(即使是在46 d MRD检测阴性的患者)预后也较差。如果在19 d MRD水平≥10－2或者在46 d检出任何水平的MRD，预后都差。Lussana等[20,21]也有类似的报道。
移植前、后MRD水平不仅可以判断预后和预测复发，还有助于选择移植时机。ALL－BFM－SCT 2003试验组研究显示，移植前MRD水平与EFS呈负相关(P＝0.009)，与非复发致死的累计发病率呈正相关(P＝0.039)，与累计复发率呈无相关性(P＝0.348)；移植后MRD水平与EFS呈负相关(P＝0.004)，与累计复发率正相关(P<0.01)。多变量Cox模型拟合检测时间点分析表明MRD≥10－4与较差的EFS相关(P<0.003)[22]。Umeda等[23]回顾性分析了第1次接受异基因造血干细胞移植(Allo－HSCT)的38例ALL患儿，研究显示CR与非CR组以及MRD阴性组与MRD阳性组之间移植后3年EFS差异有统计学意义。2例MRD阳性组患儿在移植后1年内复发，MRD阳性组和非CR组的临床预后均很差。也有研究显示MRD阴性患者在补救方案1(S1)时进行Allo－HSCT，EFS和OS明显优于在补救方案2(S2)时进行移植[24]。此外，移植后MRD水平也可以指导干预治疗，如指导供者淋巴细胞输注和环孢素的应用[25]。
MRD是复发ALL患者的独立预后因素，并可以指导其治疗。美国St.Jude儿童医院研究显示，MRD≥10－4患者2年累积第2次复发率明显高于MRD<10－4患者，分别为70%、28%。在治疗结束后第1次复发的患者中，MRD≥10－4的第2次复发率为49%，而MRD<10－4者为0。在复发后仅接受化疗的患者，2组第2次复发率分别为82%、25%[26]。对第2次缓解的复发患者，MRD检测还可用于指导第2次缓解后治疗方案的选择[27]。也有研究表明，无论MRD水平高低，复发ALL患者在S1治疗时MRD转阴比在S2治疗时预后更好[24]。
根据MRD水平实施不同的治疗方案，结局明显不同[28]。Pieters等[29]对标危组降低治疗强度，中危和高危组接受强化治疗，结果显示标危组5年EFS明显高于其他组。美国儿童癌症协作组(COG)采用AALL0232方案治疗显示，诱导治疗末MRD<10－4 5年EFS高于MRD≥10－4的患儿；巩固治疗末MRD由阳性转为阴性的患者EFS显著高于MRD阳性的患儿；强化治疗虽未改善MRD>10－3的患者5年EFS或OS，但改变了MRD阳性患者的病程，为提前采取干预措施提供了时机[28]。因此，对MRD动态监测可直接反映体内白血病细胞的负荷量，并有助于制定个体化的治疗方案。
综上所述，儿童ALL－MRD最主要的检测技术是MFC和qPCR，且2者在技术上相互补充，联合使用可覆盖更多的受检者，提高MRD检出率[30]。近几年兴起的IR－SEQ，在一定程度上弥补了MFC和qRT－PCR的不足，但该方法所面临的主要挑战是不同实验中心结果的标准化难以统一[13]。对MRD进行动态检测，不仅可以评估早期治疗反应、进行危险度分组及调整治疗方案，而且可以判断预后、预测复发，还可以指导造血干细胞移植、复发ALL治疗及个体化治疗。随着MRD检测技术可靠性的提高和标准化的统一，儿童ALL患者疗效也会得到大大的提升。
