分析新生儿鸟氨酸氨甲酰转移酶缺乏症(OTCD)的临床特征及鸟氨酸氨甲酰转移酶(OTC)基因突变位点。
分析1例疑诊新生儿OTCD患儿的临床特征，采用高通量测序技术筛选遗传代谢疾病相关基因，应用聚合酶链反应和Sanger测序的方法对患儿及其父母血样进行OTC基因突变检测。中国知网和万方数据库上检索文献，比较分析国内已报道新生儿OTCD患儿的临床特征及OTC基因突变位点。
本例患儿男性，日龄6 d，因"气促6 d，反应差、发热伴抽搐1 d"入院，质谱分析显示血氨>500 μmol/L，乳酸5.7 mmol/L。基因检测发现患儿OTC基因第2外显子发生c.176T>G (p.Leu59Pro)错义突变，是一新发现的OTC基因突变位点。文献报道国内有18例新生儿OTCD患儿，全为男性，临床上多数表现为反应差、吃奶差或呕吐、呼吸困难、抽搐、嗜睡或昏迷等症状，质谱结果显示患儿血氨均明显升高，仅7例患儿行OTC基因突变分析。
本研究丰富了新生OTCD患儿的临床表现和基因突变类型，高通量测序技术可用于疑诊OTCD患儿的基因检测，OTC基因c.176T>G是一新发生的错义突变，国内外未见报道。
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鸟氨酸氨甲酰转移酶缺乏症(OTCD)是由鸟氨酸氨甲酰转移酶(OTC)缺乏引起，是尿素循环酶缺陷中最常见的X染色体连锁隐性遗传病。人OTC基因(NM_000531.3.)位于Xp21.1，全长73 kb，包含10个外显子，目前国际上已报道超过400种基因突变类型。OTCD发病率为114 000，男女发病率基本相同。男性多在新生儿期发病，早期临床特征为喂养困难、呕吐、呼吸困难、嗜睡、惊厥和昏迷等症状，易与严重感染、缺氧缺血性脑病等混淆，患儿往往在确诊前死亡[1]。采用高通量测序筛查、聚合酶链反应(PCR)及Sanger测序相结合的方法不仅可以诊断OTCD，同时可以筛查出无症状携带者，为有家族史的个体进行遗传咨询和产前诊断提供理论依据。本研究对1例疑诊遗传代谢疾病患儿进行基因筛查，对检测到的突变基因进行家系验证，确诊此疑诊病例为OTCD。本研究系统分析了目前国内已报道的新生儿OTCD患儿的临床特征和基因突变位点，为早期诊断、治疗、遗传咨询和产前诊断提供理论依据。
患儿，男，6 d，第4胎，第1产，胎龄37＋1周，产前检查提示羊水少，母亲患妊娠糖尿病，妊娠合并血小板减少，顺产，患儿出生体质量2 800 g，1 min、5 min Apgar评分为8分和9分。因"气促6 d，反应差、发热伴抽搐1 d"入院。血气分析：pH 7.67，动脉血二氧化碳分压[pa(CO2)] 16.9 mmHg(1 mmHg＝0.133 kPa)，动脉血氧分压[pa(O2)] 98 mmHg，碳酸氢根(HCO3-) 19.7 mmol/L，碱剩余(BE) 0.8 mmol/L，二氧化硫(SO2) 99.9%，钾离子3.81 mmol/L，钠离子139 mmol/L，氯离子104 mmol/L，钙离子0.82 mmol/L。质谱分析显示血氨>500 μmol/L，乳酸5.7 mmol/L，有急诊血液净化指征，与患儿家长沟通后，行右侧颈内静脉置管、连续性血液净化治疗。考虑先天性尿素循环障碍可能性大，建议完善血尿遗传代谢疾病筛查及基因检测。请肾内科会诊后分别于入院1、3、4 d行血液透析治疗，血液透析疗效显著，生命体征尚平稳，血氨迅速下降，患儿神志渐转清，于入院3 d后下午撤离呼吸机。患儿行第3次血液透析治疗时，透析过程顺利，但患儿于透析结束后10 h左右突发病情变化终死亡。氧帐吸氧下出现面色发绀。查体：意识清，精神极度萎靡，可见吸气三凹征，听诊两肺呼吸音粗，心率50次/min，四肢末梢凉，机械通气后肺部存在感染甚至全身感染导致呼吸衰竭。患儿尸体未行解剖，死因不明。家族史：患儿父母非近亲结婚，患儿母亲既往妊娠4次，自然流产1次，胚胎停育2次，否认家族性遗传疾病史。
本研究经医院医学伦理委员会批准，征得患儿监护人知情同意后，入院3 d时抽取患儿外周血约2 mL，置于乙二胺四乙酸抗凝管中，混匀后置于－80 ℃冰箱保存。样品送至武汉康圣达医学检验所有限公司检测，通过高通量测序(Illumina Hiseq)技术进行遗传代谢疾病基因筛查，采用基因检测智能操作系统(Genetic Testing Intelligent Execution System)进行注释，SNPEFF软件(hg19，GRCh37)进行变异解读，其中功能性的编码区和剪切位点的变异将进入下一步分析。通过ClinVar、在线人类孟德尔遗传(On－line Mendelian Inheritance in Man)和人类基因突变数据库(HGMD)等查找变异位点或疑似致病突变的收录情况，进行基因突变致病的注释等。
入院3 d时抽取患儿及其父母外周血约2 mL，按照Takara Blood Genome DNA Extraction Kit试剂盒的说明书，提取家系成员的外周血基因组DNA。
根据高通量测序的分析结果，使用Primer 5.0软件设计OTC基因2号外显子的扩增引物，引物序列见表1。以家系成员DNA为模板，使用Taq DNA聚合酶扩增，扩增条件：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，65 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，循环25次；95 ℃变性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，循环20次；72 ℃延伸10 min，4 ℃延伸10 min。10 g/L琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，PCR产物经切胶纯化后待用。
OTC基因突变验证用PCR扩增引物序列
PCR amplification primer sequences used for OTC gene mutation validation
OTC基因突变验证用PCR扩增引物序列
PCR amplification primer sequences used for OTC gene mutation validation
| 扩增区域 | 引物名称 | 引物序列5′－3′ |
|---|---|---|
| exon 2 | chrX：38262933－F | TGAGTTGCTCTGTGTAATGCA |
| exon 2 | chrX：38262933－R | TTCTGTGGCCTCACCTGTG |
注：OTC：鸟氨酸氨甲酰转移酶
OTC：ornithine transcarbamylase
纯化的PCR产物在全自动测序仪ABI377(Applied Biosystems，美国)上进行双向测序，测序结果用Chromas (version 2.23)软件分析，并在National Center for Biotechnology Information中序列比对检索工具(BLAST)与正常序列(NM_000531.3.)进行比对分析。
以"鸟氨酸氨基酰转移酶缺乏症"为检索关键词，以患儿≤30 d为依据，在中国知网(http：//www.cnki.net/)和万方数据库(http：//www.wanfangdata.com.cn/)中进行相关文献检索，获取新生儿OTCD患儿资料及病例报道。
通过文献检索，目前国内已报道的新生儿OTCD患儿18例，患儿全为男性，出生后可立即发病，病程短，病死率高(13例已知死亡，4例出院后情况不明，仅1例已知存活)[2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13]。18例患儿中，14例反应差，11例进奶差或呕吐，12例呼吸困难，9例抽搐，6例嗜睡或昏迷，18例质谱结果全部显示血氨明显升高。此外，14例患儿存在类似家族病史或其母亲有不良孕产史。
通过Illumina Hiseq测序平台筛查了遗传代谢疾病相关基因，测序目标区覆盖度为99.9%、目标区平均深度为182、目标区平均深度>20X比例为99.7%，测序质量符合要求。该样本在OTCD相关基因OTC发现一处半合子突变，OTC基因第2外显子(chrX：38226642)发生c.176T>G (p.Leu59Pro)错义突变，在HGMD数据库搜索该突变位点未见报道，因此该突变为OTC基因的1个新突变位点。PCR扩增和Sanger测序家系验证结果显示该半合子突变来自其母亲(图1)，其母亲为杂合突变携带者，符合X染色体隐性遗传规律。
注：OTCD：鸟氨酸氨甲酰转移酶缺乏症；A：患儿存在c.176T>C的半合子突变；B：患儿父亲无突变；C：患儿母亲存在c.176T>C杂合突变；红色圈内所指为基因突变所在碱基位置
18例报道中，仅7例行OTC基因突变分析(表2)[2,3,4,5,11]。7例患儿皆为半合子突变，其母亲皆为杂合突变携带者，符合X染色体隐性遗传规律。例6患儿OTC基因在第9外显子存在c.958C>T无义突变，在第9和5内含子分别存在插入和杂合突变(c.1005＋132 InsT，c.542＋134 G>G/A)，其他患儿OTC基因仅存在1个外显子上的错义突变。例7患儿母亲在围生期表现出OTCD临床症状，但例7外祖母表型正常，其他患儿母亲皆表型正常。
OTCD患儿OTC基因突变分析
Summary of OTCD parents with OTC gene mutations
OTCD患儿OTC基因突变分析
Summary of OTCD parents with OTC gene mutations
| 例序 | 基因突变型 | 参考文献 |
|---|---|---|
| 例1 | 第9外显子c.917G>C (p.R306T)错义突变，母亲及家系中另外2名女性皆为该位点的杂合突变携带者，表型正常 | 孟露露等[2]，2013 |
| 例2 | 第6外显子c.548A>G (p.Y183C)错义突变 | 王艳等[3]，2014 |
| 例3 | 第10外显子c.1016T>G (p.V339G)错义突变，母亲为该位点的杂合突变携带者，表型正常 | 王艳等[3]，2014 |
| 例4 | 第9外显子c.995G>C (p.W332S)错义突变 | 王艳等[3]，2014 |
| 例5 | 第5外显子c.516C>G (p.I172M)错义突变，母亲为该位点的杂合突变携带者，表型正常 | 莫韦倩等[4]，2011 |
| 例6 | 第9外显子c.958C>T无义突变，精氨酸的密码变成终止密码。母亲为该位点的杂合突变携带者，表型正常。患儿和母亲的9号和5号内含子分别存在插入和杂合突变，分别为c.1005＋132 InsT和c.542＋134 G>G/A | 孙卫华等[5]，2011 |
| 例7 | 第6外显子c.583G>A (p.G195R)错义突变，母亲及外祖母均为该位点的杂合突变携带者，母亲为围生期发病的OTCD患者，外祖母表型正常 | 杨凌云等[11]，2015 |
注：OTCD：鸟氨酸氨甲酰转移酶缺乏症
OTCD: ornithine transcarbamylase deficiency
根据OTCD患者发病时间，可分为2种类型：新生儿型(≤30 d)和迟发型(>30 d)。新生儿期患儿一般发病迅速，如未能及时诊断治疗，患儿预后差，尤其是男性患儿，极易导致死亡[6,11]。本研究报道病例和文献分析显示，临床疑诊新生儿OTCD患儿一般表现为反应差、吃奶差或呕吐、呼吸困难、抽搐、嗜睡或昏迷等症状，质谱结果显示血氨水平明显升高。然而，OTCD的临床特征缺乏特异性、易误诊、预后差，确诊OTCD的方式依然是肝组织活检OTC酶活性或外周血OTC基因突变分析。基因突变分析血样易于采集，DNA测序结果稳定，该结果不仅可尽早确诊还可对个体的遗传咨询和产前诊断提供重要信息。因此，本研究疑诊病例通过高通量测序方法筛查了遗传代谢疾病全面基因，发现OTC基因在第2外显子上存在c.176T>G (p.Leu59Pro)错义突变，该突变尚未见报道，是一新发现的OTC基因突变位点。家系样本PCR扩增后Sanger测序验证了此突变位点，符合X染色体隐性遗传的规律。结合临床特征和基因突变分析结果，确诊此病例为OTCD。先通过高通量测序技术进行疾病相关基因筛查，再行PCR扩增及Sanger测序家系验证的检测方法，结果准确可靠，可避免漏检和误诊。
本研究及文献报道新生儿OTCD患儿质谱结果皆提示血氨水平异常升高。此外，本例患儿母亲既往妊娠4次，自然流产1次，胚胎停育2次，具有明显不良孕产史；文献报道的18例新生儿OTCD患儿中，14例患儿存在类似家族病史或其母亲有不良孕产史。因此，当患儿具有先天性尿素循环障碍临床特征、血氨水平异常升高、存在类似家族病史或其母亲有不良孕产史时，临床医师需怀疑患儿罹患OTCD的可能，需及早进行血尿遗传代谢疾病筛查和基因检测。
国内报道的18例新生儿OTCD患儿全为男性，7例患儿行OTC基因突变分析，全为半合子突变，符合X染色体隐性遗传规律，突变位点皆来自母亲[2,3,4,5,11]。7例患儿皆存在外显子上的突变，例6患儿还存在第9和5内含子的插入和杂合突变(c.1005＋132 InsT，c.542＋134 G>G/A)。目前国内报道的7例患儿基因检测皆采用常规PCR技术直接进行OTC基因突变分析，通常是扩增OTC基因的10个外显子依次比对分析。当类似遗传代谢疾病相关基因发生致病突变时，此方法易导致类似疾病的漏检或误诊。高通量测序技术具有检测速度快、准确率高、成本低、覆盖面广等特点。采用高通量测序技术进行遗传代谢相关基因全面筛查可避免以上漏检或误诊，结合一代测序家系验证，使得DNA测序结果准确可靠，不仅可帮助临床医师及早确诊和干预治疗，还可为遗传咨询及产前诊断提供可靠依据。
