新生儿缺氧缺血性脑病(HIE)是新生儿围生期死亡和后期神经发育障碍的重要原因，传统治疗方案对改善预后的效果甚微，亚低温治疗是过去10年中最有效的治疗方法，但临床应用受胎龄、发病时间限制。当前，干细胞移植是治疗HIE新的研究方向，其中间充质干细胞因其取材容易、低免疫源性和潜在神经再生属性等优势在未来临床应用中最具前景。现就间充质干细胞移植治疗新生儿HIE的研究进展进行综述。
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新生儿缺氧缺血性脑病(hypoxic-ischemic encephalopathy，HIE)是由围生期窒息引起的部分或完全缺氧、脑血流减少或暂停导致的围生期胎儿或新生儿脑损伤，是新生儿围生期死亡和后期神经发育障碍的重要原因，幸存者常遗留不同类型和程度的神经系统后遗症，包括脑性瘫痪(脑瘫)、癫痫、视听障碍、智力障碍及学习问题等，严重影响患儿的生活质量[1]。传统的治疗措施，包括"三支持"、"三对症"等基础治疗和改善脑代谢药物、肢体功能训练等辅助治疗，但对于减轻迟发性神经损害和改善预后效果甚微。亚低温治疗是过去10年中最有效的治疗方法，但使用及疗效受胎龄、发病时间限制，且仍有超过40%的患儿在接受亚低温治疗后遗留神经系统后遗症，甚至死亡[2]。因此，探索HIE治疗的新方法非常有必要。新生儿脑处于快速发育阶段，具有易损性强和可塑性强的双重特点，干细胞移植治疗通过细胞替代效应、旁分泌的因子效应、促血管生成改善氧供等作用有望成为逆转脑损伤的新手段，其中，间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)因其相对易获取、低免疫源性和潜在神经再生属性，在未来临床应用最有前景。现就MSCs移植治疗新生儿HIE的研究进展进行综述。
缺氧缺血(HI)脑损伤后，会出现按时间顺序发生的特征性的"瀑布"式病理生理级联反应。这对认识HIE发生发展的过程，并对临床治疗选择恰当的干预时机十分重要。
HI发生的早期(数小时)，即发生原发性能量衰竭，尽管代谢障碍会导致部分细胞的变性、水肿甚至死亡，但机体很快出现全身代偿性血流重新分布，即脑部血流增加。试验证实，窒息后脑局部血流增加，但表现出明显的区域差异性，在脑干、丘脑等代谢旺盛的重要区域血供更充足[3]，代偿性血流再灌注可暂时性改善氧代谢障碍。
HI后6～24 h，即二次能量衰竭[4]，此时脑血流持续再灌注，新生儿脑血管的自主调节功能尚未发育完善，缺氧时脑血管内皮细胞舒缩功能减弱或丧失，脑血流受系统血压冲击，出现低灌注或过度灌注。脑氧合和灌注恢复，超氧阴离子(O2－)大量产生，超氧自由基攻击双层脂质生物膜[5]，细胞内Ca2＋超载伴兴奋性氨基酸的"兴奋毒"作用等参与神经元迟发性死亡过程[6]。此阶段线粒体功能障碍在细胞凋亡中发挥重要作用，线粒体膜受损释放细胞色素C至胞质，激活半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase)级联反应，促进细胞凋亡[7]。此期有大量细胞损伤或凋亡，可持续数天甚至数周。有明显二次能量代谢衰竭的患儿往往会出现脑发育速度减慢。
持续性(数天至数年时间)的细胞变性、水肿甚至死亡与神经营养因子耗竭、招募神经干细胞与胶质前体细胞失败有关，甚至发生表观遗传学的变化(如甲基化等)，但更多机制尚不完全清楚[8]。
事实上，HIE不可逆性脑损伤的结局是多种发病机制交互作用的结果，目前认为，二次能量衰竭期细胞大量死亡，避免或减轻二次能量衰竭的发生是保护脑细胞的重要环节，故理论上发生于二次能量衰竭前是治疗的黄金时间窗。
移植的细胞增殖、分化为神经元和胶质细胞，替代受损的细胞。HI发生时，血脑屏障在损伤微环境作用下通透性增加[9]，使静脉、动脉、腹膜等途径输注细胞到达局部成为可能。相对损伤区的星形胶质细胞、内皮细胞分泌基质细胞衍生因子-1α(stromal cell derived factor－1α，SDF-1α)等趋化因子增多，可招募表达CXC家族趋化因子受体4(CXC chemokirte receptor－4，CXCR-4)的移植细胞迁移到受损部位[10,11]。Park等[12]发现动物模型中脑室内提前植入的神经干细胞保持沉默，直到接收到HI刺激才发生分化，并迁移至梗死区，分化成神经元和少突胶质细胞，提示损伤部位存在可以诱导移植细胞分化，并引导其"归巢"的物质。同样，Donega等[13]在小鼠脑损伤模型中经鼻内输注荧光标记的人MSCs，24 h后即可在损伤侧脑内检测到荧光信号，而损伤对侧脑未检测到荧光信号，同时将鼠神经干细胞与人MSCs共孵育，可诱导鼠神经干细胞分化。许多研究报道虽然细胞移植后动物模型脑损伤程度减轻，但随着时间推移，可检测到的细胞数减少，局部增殖的细胞有限[13,14]。可能与细胞移植的方法学，如移植细胞数量、输注方式、输注时间有关，不同背景下移植细胞替代效应发挥程度不同，但不能否认移植细胞迁移至受损部位并分化成熟，替代受损神经元、神经胶质细胞，从而形成新的神经网络，替代损伤区脑功能可能是细胞移植治疗HIE的机制之一。
移植后的干细胞分化为神经细胞的数量少，即使有分化，也不一定是具有完整功能的神经元或胶质细胞[15,16]，故移植细胞旁分泌的因子效应是脑保护的另一大机制。移植细胞还可分泌神经胶质细胞衍生神经营养因子(GDNF)、促血管生成素(Ang)、神经营养因子(NT)-3、NT-4等[17]。Cheng等[18]首先发现动物模型中HI时脑室内预注射脑源性神经营养因子(brain－derived neurotrophic factor，BDNF)可降低细胞凋亡标志物Caspase-3的表达，并使组织丢失由50%减少至10%。Wilkins等[17]发现MSCs可分泌BDNF通过激活PI3激酶/Akt信号传导途径，帮助鼠皮质神经元幸免于营养剥夺及一氧化氮诱导的死亡，在培养基中加入BDNF抗体后，其神经保护作用减弱。同样，Guardia Clausi等[19]在脑损伤动物模型鼻内输注胰岛素样生长因子-1(insulin－like growth factor-1，IGF-1)和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)可提高神经系统功能，并减少梗死区域，输注表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)可减少白质损伤和炎性反应，并促进少突胶质前体细胞(oligodendroglial progenitor cells，OPCs)的存活。临床研究也表明HIE新生儿经脑室内输注神经生长因子(nerve growth factor，NGF)后，脑电图及脑血流均有所改善[20]。因此，植入细胞通过分泌的各类因子，抑制宿主神经细胞凋亡、促进轴突再生、促进血管再生和神经干细胞增殖与分化来发挥保护作用。
HI后"瀑布"式炎性级联反应在脑损伤中发挥重要作用，控制炎性反应可能改善脑损伤的预后。研究认为源于人羊膜的多能前体细胞能减少炎症，降低单核细胞化学引诱蛋白-1、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素(IL)-1/IL-6和TNF-β水平，下调组织抑制因子和基质金属蛋白酶-1/2[21]。脑缺血诱导损伤48 h后，局部TNF-α、干扰素(IFN)-γ、IL-17升高，其中TNF-α可促进白细胞浸润、破坏血脑屏障，IFN-γ可直接导致细胞死亡，而移植胎盘来源间充质干细胞后，检测损伤脑局部及血浆TNF-α、IFN-γ、IL-17水平降低，保护因子IL-10显著升高[22]。同样，HIE模型中脐血干细胞移植后TNF-α、IL-1α、IL-1β表达降低，同时活化巨噬/单核细胞群减少[23]。说明移植细胞具有免疫调节作用，可减轻脑损伤导致的炎性反应。
MSCs可来源于脐带、胎盘、华氏胶、血液及骨髓等，不同组织来源的MSCs具有相似的生物学特性，其中来源于胎儿附属产物的MSCs较成人组织来源的MSCs免疫源性更低，有更强的增殖能力和自我更新能力[26]。此外，MSCs由于低表达主要组织相容-Ⅱ抗原且可抑制免疫细胞增殖，使同种异体移植更具安全性，更利于未来市场化运用。MSCs在体外可以分化为神经元样细胞，但植入体内后MSCs分化为神经元样细胞的能力有限，大部分研究认为其主要依靠旁分泌效应发挥脑保护作用，一方面降低了致瘤的风险，但另一方面限制了细胞替代作用的发挥[26]。Divya等[27]研究发现这与MSCs的某一亚群比例有关，在体外培养条件下，表达多能干细胞标志物Oct4、Nanog、Sox2、ABCG3等MSCs亚群通过简单的神经诱导即可分化为神经元，而仅表达经典MSCs标志物的细胞需经生长因子刺激后分化为神经元的比例才增加。治疗使用的MSCs需满足国际干细胞生物学学会(International Society for Stem Cell Research，ISSCR)规定的MSCs特性：(1)可贴附塑料生长；(2)CD73、CD90和CD105强阳性表达，而CD34、CD45、CD14/CD11b、CD19/CD79α、人类白细胞DR抗原等标志物应为阴性表达；(3)具备成骨、成软骨和成脂分化能力[28]。
MSCs可通过系统(动脉/静脉、腹膜腔)、局部(脑内、脑室内、鞘内、鼻内)及其他(腹膜)方式输注。新生儿脑损伤不稳定期，患儿耐受性低，局部脑室内注射干细胞较系统输注风险性更大。然而，窒息时周围脏器同样处于缺氧状态，MSCs易被拦截，加上血脑屏障的阻隔，使最终达到脑部的干细胞数量有限。Fischer等[29]经大鼠模型颈内静脉输注荧光标记的MSCs后，红外显像显示肺、心、肾、脾、肝均高信号，提示静脉输注的MSCs被这些组织拦截。同样，Ahn等[30]研究发现在脑室内出血大鼠模型中，对比静脉输注和脑室内输注，达到同一治疗效应，经静脉输注MSCs的剂量是脑室内输注的5倍。因此，局部输注效益更大。Fang等[31]构建脊髓缺血再灌注损伤动物模型，经鞘内输注1×108骨髓来源基质细胞后可降低神经运动缺失及炎性因子，如金属蛋白酶-9(Matrix metalloproteinase－9，MMP-9)和TNF-α的表达。近年来，鼻内注射胰岛素、催产素或生长因子、神经肽治疗中枢神经系统疾病多见[32]。Donega等[33,34]在HI鼠模型中经鼻内输注0.5×106 MSCs，分别于输注后10 d、28 d、6个月、9个月检测感知运动功能，于输注后3个月、14个月检测认知功能，发现输注后14个月在鼻甲、脑或其他37个器官中未发现新生物，且感知运动及认知功能的改善可持续很长时间，表明鼻内输注的有效性及安全性，后续研究认为鼻内注射MSCs到达脑部的可能途径为随嗅神经及三叉神经分布，通过筛板及脑桥到达脑部，通过脑膜循环、脑脊液循环扩散。在局部输注中，鼻内输注具微创、快速、有效等优点可能成为最佳输注途径。但相对于啮齿类动物，人的嗅球欠发达，目前发表的结果仅限于临床前期，尚无鼻内输注MSCs的临床试验，鼻内输注效果在临床试验中是否有效，仍有待进一步研究。
剂量取决于输注的途径和损伤时间。Donega等[35]研究表明9日龄HIE小鼠鼻内输注MSC最佳剂量是1×106，最小有效剂量是5×105。同样，van Velthoven等[36]研究发现，新生鼠脑损伤后10 d颅内输注1×105 MSCs可提高功能预后。如前所述，在IVH诱导脑损伤新生鼠中通过选择局部输注，相比静脉输注可减少5倍细胞量[30]。临床MSCs治疗小儿严重脑损伤及神经残疾专家共识推荐剂量如下：脑实质途径106个，细胞容积不超过200 μL；侧脑室途径细胞数(6～10)×106，细胞容积不超过500 μL；腰椎穿刺途径：细胞数(6～10)×106，细胞容积不超过2 mL；动脉/静脉途径：细胞数6×106/kg，细胞容积10～20 mL[37]。具体的输注最佳剂量与途径及脑损伤时间的对应关系有待进一步研究。
亚低温等神经保护治疗通常在数小时内有效，而MSCs治疗新生儿脑损伤的时间窗选择变异性大，从数小时至数天不等，可能与动物模型和脑损伤严重程度有关。成年动物模型中大脑中动脉梗阻3～24 h输注MSCs，损伤皮质中抗凋亡因子生存素和Bcl-2表达升高，且运动感知功能均有所提高[24,38]。然而，由于MSCs的旁分泌效应，治疗时间窗可能更广泛。Donega等[35]在9日龄小鼠HI发生后分别于第3天、第10天和第17天输注同等剂量PHK-26染色剂标记的MSCs，发现HI后第3天输注的MSCs在24 h内集中至损伤海马区，损伤发生10 d后扩散至脑其他部位；第10天输注的MSCs局限于皮质和丘脑的特定区域；第17天输注MSCs局部仅检测到零星的信号，对损伤区感知运动功能无任何改善，这可能与损伤区趋化信号减少有关。所以治疗时间窗在HI 17 d内。由于2～3周啮齿类动物相当于0.5～2.0岁幼儿，将上述时间转化为人类胎龄，可推测MSCs输注在人类的时间窗至少是1个月[39]。按HIE发生发展过程，最佳输注时机应在"二次能量衰竭"爆发前，即6～24 h效果最佳，但MSCs通过其旁分泌因子效应、抗炎及免疫调节作用在后续慢性期的炎症反应及脑保护中也可发挥一定作用，提高神经功能预后。总之，脑损伤后尽早移植MSCs能获得更好的疗效，急性期后的治疗可能也有一定效果，具体的治疗时间窗及最佳输注时间有待进一步研究。
异体移植具有肿瘤形成、炎性反应和移植物抗宿主反应等风险。但动物实验表明MSCs移植后3 d数量减少，成瘤概率小，且新生鼠HIE鼻腔移植MSCs 14个月后仍可发挥保护效应，且未在鼻甲、脑和其他器官发现新生物[33,34]。2012年发表的一篇荟萃分析未发现严重不良反应的证据，该研究调查了自体或异体MSCs移植治疗成人及儿童不同疾病的报道，发现MSCs治疗与急性输液反应、感染、系统并发症及成瘤无关，仅出现暂时性低热[40]。总之，使用MSCs治疗动物实验未发现比对照组有更高的并发症发生率，临床试验仅发现暂时性低热，MSCs治疗具有一定的安全性及可行性。
总之，干细胞移植可能改变传统的HIE治疗方式，MSCs具有相对易获取、低免疫源性和神经再生、疗效具安全性和伦理争议少等优势，有望成为细胞治疗HIE的种子细胞。目前动物实验与单中心随机对照临床研究[41]已取得一定成果，但不能排除发表偏倚的存在，进行多中心临床对照研究很有必要。此外，MSCs治疗HIE的标准方法，临床适应证、时间、剂量及与亚低温联合等有待进一步研究。通过不断的努力，相信干细胞移植将成为继亚低温治疗HIE后的又一个里程碑！
