白血病是因造血干/祖细胞在分化过程中的不同阶段发生分化阻滞、凋亡障碍和恶性增殖而引起的一组异质性的造血系统恶性疾病；急性白血病(AL)阻滞发生在较早阶段，按照细胞来源分为急性髓系白血病(AML)和急性淋巴细胞白血病(ALL)^[1]。急性巨核细胞白血病(AMKL)根据FAB协作组的分型属于AML－M7型，其发生率占儿童AML的4.0%～15.0%^[2]，常并Down综合征(DS)^[3]。混合谱系白血病(MLL)基因定位于11号染色体长臂2区3带(11q23),其与4号染色体长臂2区1带(4q21)易位t(4; 11 )形成的MLL－AF4融合基因多见于小儿B细胞系ALL(B－ALL)^[4]。广州市妇女儿童医疗中心收治1例AMKL伴MLL－AF4融合基因患儿，现报告如下，以期为AMKL的诊治提供经验。

患儿，男，5岁，因"头晕无力、贫血、血小板减少3个月"入院。入院查体：贫血貌；颈部及胸部可见散在的针尖样皮下出血点；肝、脾、淋巴结未及肿大。血常规：白细胞6.7×10⁹/L，红细胞2.69×10¹²/L，血红蛋白85 g/L，血小板45×10⁹/L。五分类血细胞分析仪分析未提示幼稚细胞。血涂片人工分类：中性分叶核细胞占0.09，淋巴细胞占0.82，单核细胞占0.01，可见一类原始幼稚细胞占0.08。骨髓穿刺检查：骨髓增生明显活跃，髓系细胞占0.02，红系细胞占0.01，淋巴细胞占0.06，可见一类原始幼稚细胞占0.91，此类细胞胞体较小、大小不一、边缘不整齐、呈锯齿状或云雾状、有指状或泡状突起，胞质量少、呈蓝色或灰蓝色、着色不均、不透明，部分细胞胞质中有空泡，可见胞质在突起后呈球状或片状脱落，胞核圆形，可见凹陷折叠等变形，不如单核细胞明显，核染色质呈粗颗粒状，胞核1～ 3个，较原始粒细胞少。骨髓细胞组织化学染色：此类原始幼稚细胞呈过氧化物酶(POX)反应阴性、糖原(PAS)反应阳性、醋酸AS－D萘酚酯酶(NAE)反应阳性。流式细胞术免疫分型检查：此类原始幼稚细胞CD7、CD9、CD₁₃、CD₃₃、CD₃₄、CD₃₆、CD_41a、CD_42b和CD₆₁表达阳性；CD2、CD3、CD4、CD5、CD8、CD₁₀、CD_11a、CD_11b、CD_11c、CD₁₄、CD₁₅、CD₁₉、CD₃₅、CD₃₈、CD₄₄、CD₅₆、CD₆₄、CD₉₅、CD₉₉、CD₁₁₇、CD₁₂₃、人类白细胞抗原DR(HLA－DR)、cCD3、cCD_79a和细胞内髓过氧化物酶(cMPO)表达阴性。主要表达原始髓系细胞和巨核细胞标志，提示符合AMKL的免疫分型。结合以上各项检查结果分析，考虑诊断该患儿为AML－M7型。染色体核型分析：采用直接法、24 h培养法和同步法制备染色体；G显带技术显带；根据《人类细胞遗传学国际命名体制(ISCN，1995 )》描述核型：46，XY，t(4；11)(q21；q23)，del(12)(p11)[9]/46，XY[1]。间期细胞荧光原位杂交(FISH)检测：采用染色体短期培养法培养的标本，气干法滴片，实验方法按说明书操作，分析间期细胞400个。在检测范围内，MLL探针可见阳性信号，阳性率约为93.0%，见图1。反转录多重巢式聚合酶链反应(RT－PCR)检测：于初诊化疗开始前采集骨髓标本2 mL；用淋巴细胞分离液提取单个核细胞；按Trizol一步法提取细胞总RNA；以禽成髓细胞白血病病毒(AMV)反转录酶合成cDNA；检测的融合基因及引物序列见文献^[5]。结果显示融合基因MLL－AF4检测阳性，见图2。实时荧光定量RT－PCR(RQ－PCR)检测：采用RT－PCR的标本，进行RQ－PCR检测，结果显示融合基因MLL－AF4阳性，见图3。按AML方案行柔红霉素＋阿糖胞苷联合化疗(DA)方案诱导缓解化疗1个疗程，骨髓完全缓解(CR)；随后予柔红霉素＋阿糖胞苷＋依托泊苷联合化疗方案(DAE)巩固化疗1个疗程；大剂量阿糖胞苷根治性化疗1个疗程；化疗过程中予输注红细胞悬液与血小板支持、防治感染等综合治疗；未出现明显不良反应和并发症。随后监护人放弃治疗自动出院。所有检查及治疗患儿监护人均知情同意并签署知情同意书，本研究经医院医学伦理委员会批准[穗妇儿伦审批第(2016103101)号]。

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图1

急性巨核细胞白血病伴MLL－AF4融合基因患儿间期细胞荧光原位杂交检测MLL基因重排的结果

Figure 1

MLL gene rearrangement by fluorescence in situ hybridization in the patient with Acute megakaryoblastic leukemia with MLL－AF4 fusion gene

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注：MLL：混合谱系白血病；MLL分离信号阳性，显示1个红色、1个绿色及1个黄色融合信号(1R1G1Y)　MLL：mixed lineage leukemia；positive signal mode of MLL gene rearrangement，display 1 red，1 green and 1 yellow signals(1R1G1Y)

图1

急性巨核细胞白血病伴MLL－AF4融合基因患儿间期细胞荧光原位杂交检测MLL基因重排的结果

Figure 1

MLL gene rearrangement by fluorescence in situ hybridization in the patient with Acute megakaryoblastic leukemia with MLL－AF4 fusion gene

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图2

反转录多重巢式聚合酶链式反应检测急性巨核细胞白血病伴MLL－AF4融合基因患儿MLL－AF4融合基因结果

Figure 2

Reverse transcription－ multiplex nested PCR results for MLL－AF4 fusion gene of patient with acute megakaryoblastic leukemia with MLL－AF4 fusion gene

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注：M：Marker；1：患儿；2：阴性对照；3：MLL－AF4融合基因阳性对照(420 bp)　M：Marker；1：patient；2：negative control；3：positive control of MLL－AF4 fusion gene

图2

反转录多重巢式聚合酶链式反应检测急性巨核细胞白血病伴MLL－AF4融合基因患儿MLL－AF4融合基因结果

Figure 2

Reverse transcription－ multiplex nested PCR results for MLL－AF4 fusion gene of patient with acute megakaryoblastic leukemia with MLL－AF4 fusion gene

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图3

实时荧光定量反转录多重巢式聚合酶链式反应检测急性巨核细胞白血病伴MLL－AF4融合基因患儿MLL－AF4融合基因结果

Figure 3

Real－ time quantitative PCR results for MLL－AF4 fusion gene for the patient with acute megakaryoblastic leukemia with MLL－AF4 fusion gene

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注：蓝色曲线：患儿MLL－AF4融合基因曲线；红色曲线：阳性对照；绿色曲线：阴性对照。当反应Ct值≤ 33时，判定为阳性反应　Blue curve：patient′s MLL－AF4 fusion gene；red curve：positive control；green curve：negative control.Ct value for positive reaction of MLL－AF4 fusion gene is equal to or less than 33

图3

实时荧光定量反转录多重巢式聚合酶链式反应检测急性巨核细胞白血病伴MLL－AF4融合基因患儿MLL－AF4融合基因结果

Figure 3

Real－ time quantitative PCR results for MLL－AF4 fusion gene for the patient with acute megakaryoblastic leukemia with MLL－AF4 fusion gene

AMKL是巨核系造血细胞被阻滞在某一分化阶段并异常增殖所致的AL。国内诊断标准：外周血中有巨核(小巨核)细胞；骨髓中原巨核细胞≥0.3，该原巨核细胞应有单克隆抗体或电镜证实；骨髓细胞少，往往干抽(取材失败)，活检有原始细胞和巨核细胞增多，网状纤维增加^[6]。该病的临床表现与其他类型AL类似，常有发热、贫血、出血等；AMKL的原始巨核细胞形态常发生变异，有时难以与ALL 2型淋巴细胞区别，易造成AMKL漏诊和误诊。AMKL的临床表现与白血病性原始巨核细胞有其自身特点：患儿一般无肝、脾、淋巴结大，如果存在也仅为轻度；AMKL原始巨核细胞的外形不规则、边缘不整齐、有指状突起或泡状突起；胞质可见空泡并伴伪足、部分细胞还可见到血小板生成。同时，根据AMKL的诊断标准，原始细胞单克隆抗体免疫分型检查对AMKL的诊断非常重要。有文献报道，抗血小板单克隆抗体CD₄₁与CD₆₁在幼稚及分化较差的巨核细胞内多见，CD₄₂多见于较成熟的巨核细胞，故CD₄₁、CD₄₂及CD₆₁单抗阳性对AMKL有确诊价值；除此之外，在AMKL中单抗CD₃₆也特征性阳性^[7]。本例患儿骨髓细胞形态学及细胞免疫分型均符合上述诊断标准，故AMKL诊断明确。

伴MLL基因重排的AL发病年龄低、恶性程度高、对常规化疗不敏感、缓解率低、缓解后易复发、易发生中枢神经系统白血病。WHO已将伴11q23(MLL)的AL单独列出分为一类，作为AL预后不良的独立指标^[8]。MLL基因重排包括易位、自身重复、倒位及缺失等，其中又以易位最为常见，可导致MLL与各伙伴基因融合形成融合基因。目前已报道，且在分子水平已被证实的MLL伙伴基因约有79个，包括AF4(4q21)、AF9(9p22)、AF10(10p12)及AF19(19p13.3)等；其中t(9; 11)(p22; q23)生成的MLL－AF9及t(10; 11)(p12；q23)生成的MLL－AF10是儿童AML中较常见的涉及MLL易位的融合基因，二者分别占到儿童AML涉及MLL易位形成融合基因的36.1%和19.8%；t(4; 11 )(q21; q23 )生成的MLL－AF4融合基因常见于儿童ALL，占儿童ALL涉及MLL易位形成融合基因的47.3%；其在儿童AML较为少见，只占儿童AML中涉及MLL易位形成融合基因的0.9%^[9]。对于儿童AMKL，Inaba等^[10]研究结果表明，儿童AMKL中最常见的染色体易位为t(1; 22 )(p13; q13)；涉及MLL易位形成的融合基因中最常见的是t(9；11)(p22；q23 )生成的MLL－AF9及t(10; 11)(p12；q23)生成的MLL－AF10；与FAB分型中其他类型的AML比较无明显差异。而MLL－AF4融合基因在儿童AMKL中仅有极个别病例报道^[11]。目前国内有关儿童AMKL融合基因的研究报道较少，本例患儿为中国人AMKL中首次检测到同时伴MLL－AF4融合基因的病例。

在治疗方面，由于本病进展快、预后差、联合化疗效果常常不佳，AMKL被认为是一种高度危险亚型的AL。特别是对于那些伴MLL易位的AMKL，5年无事件生存(EFS)率及总生存(OS)率仅为28.5%、32.4%^[10]。有文献报道，对non－DS－AMKL患者予强化疗为诱导缓解治疗，在初次缓解后采用HLA配型相合的异基因造血干细胞移植，3年OS率达到82.0 %，预后较传统化疗明显提高^[12]。Yang等^[13]以异基因外周血造血干细胞移植(allo－HSCT)来治疗MLL基因重排阳性AML患者，也取得了不错的疗效。可见，对于本例AMKL患儿，接受allo－HSCT或许是其治疗的最佳手段。HOX基因在胚胎发育及细胞分化过程中发挥重要作用，野生型MLL蛋白可通过调节HOX基因表达来决定细胞的存活。MLL易位导致MLL基因和来自"伙伴"染色体的配体基因融合，从而转录出融合基因转录本，编码嵌合蛋白；这些融合蛋白可通过DNA甲基化使野生型MLL基因沉默，影响其对下游HOX基因表达的调节，细胞增殖不受抑制，导致AL的发生。目前国外已有学者研究针对这些融合蛋白的靶向治疗药物，阻断其对野生型MLL基因的影响^[14]。希望将来研究能取得突破性的进展，为该亚型AL治疗提供新策略，显著改善MLL融合基因阳性AML患者的预后。