探讨ADRB2基因rs1042713和rs1042714位点多态性与儿童支气管哮喘(哮喘)易感的相关性及对治疗的反应性，并初步了解其机制。
收集2014年8月至2016年4月在郑州儿童医院门诊及住院确诊的哮喘病例组(173例)和健康对照组(166例)儿童的口腔上皮细胞，采用Taqman探针实时荧光定量检测儿童ADRB2基因编码区rs1042713和rs1042714位点的基因型，比较2组基因型分布的差异；比较哮喘病例组不同基因型患儿的治疗疗效，而后采用生物信息学分析ADRB2不同基因型对应的氨基酸序列、蛋白结构的差异。
哮喘病例组和健康对照组rs1042713位点的基因型及等位基因频率分布比较差异均有统计学意义(P＝0.001、0.000)，rs1042714位点比较差异无统计学意义(P＝0.159、0.061)。rs1042713位点GG基因型患者需要的用药剂量与AA、AG基因型患者比较差异有统计学意义(H＝12.583，P＝0.002)，但rs1042714位点各个基因型对药物的反应性比较差异无统计学意义(H＝2.696，P＝0.260)。rs1042713位点的多态性引起蛋白局部结构的不同，rs1042714位点的多态性对应的蛋白结构无差异。
ADRB2基因s1042713位点多态性不仅与儿童哮喘的易感相关，也在一定程度上影响哮喘对治疗的反应性，而rs1042714位点多态性与哮喘易感性和治疗反应性均不相关，其机制可能与不同基因型对应的蛋白结构及功能差异有关。
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支气管哮喘(哮喘)是目前世界范围内的高发病，其发病率呈逐年上升趋势，儿童哮喘已成为发达国家中发病率最高的儿科呼吸道疾病[1]。哮喘作为一种临床症状复杂的多基因遗传性疾病，目前已知是由免疫、环境与遗传等多种因素共同作用的结果，但其发病机制尚不够明确[2,3]。β2－肾上腺素受体基因(ADRB2)是目前研究比较广泛，且关注度比较高的哮喘遗传易感候选基因之一。ADRB2蛋白是一种典型的偶联G蛋白膜受体，能激活细胞内腺苷酸环化酶，引起下游一系列信号反应，产生支气管扩张等效应[4]。目前，关于ADRB2基因多态性与儿童哮喘之间的关系尚未有定论。本研究旨在分析ADRB2基因rs1042713、rs1042714位点多态性与儿童哮喘易感性的关系，对药物治疗的反应性及其可能的作用机制。
哮喘病例组来自于2014年8月至2016年4月在郑州儿童医院门诊及住院确诊的儿童哮喘患儿。样本量估计公式为[5]：n＝2pq(Uα＋Uβ)2/(p1－p2)2，其中p＝(p0＋p1)/2，q＝(1－p)，p0为所研究基因型在对照人群中的暴露率，p1＝p0*OR/[1＋p0(OR－1)]，OR为现有研究报道的该基因型患病风险比值比，取OR＝2.58[6,7]，取α＝0.05，β＝0.1，代入公式计算估计样本量为115例。按样本估算值的1.5倍扩增，共收集儿童哮喘患者173例。其中男81例，女92例；年龄2～12岁[(5.8±2.8)岁]。诊断标准[8]如下：(1)反复发作的喘息、气促、胸闷或咳嗽的轻中度哮喘；(2)发作时双肺可闻及以呼气相为主的哮鸣音；(3)支气管舒张剂有显著疗效。排除治疗过程中对于依从性较差的患儿。健康对照组来自于郑州儿童医院健康体检的儿童，共166例。其中男77例，女89例；年龄2～12岁[(6.3±3.1)岁]。健康对照组儿童均无过敏反应家族史及个人过敏反应疾病史，也无哮喘史。所有参与此次研究的受试者均经其监护人同意，并签署知情同意书，且经郑州大学附属儿童医院医学伦理委员会认证通过。2组儿童在年龄、性别等基线资料方面比较差异均无统计学意义，具有可比性(χ2＝0.006，P＝0.936；t＝0.346，P＝0.718)。
使用基因检测采样盒中的采样拭子在儿童口腔壁(左右两侧)上下各擦拭40次，收集口腔上皮细胞；采用GTpure™口腔细胞DNA快速提取试剂盒提取基因组DNA；采用Taqman探针法检测ADRB2基因编码区rs1042713、rs1042714位点的SNP。根据GenBank中ADRB2(NC_000005.10：148826593－148828634)基因序列设计引物，上游引物：ATGGGGCAACCCGGGAAC，下游引物：GATGGCCAGGACGATGAGAG。同时按照rs1042713和rs1042714位点的等位基因分别设计2条探针，FAM1、HEX1和FAM2、HEX2，引物的合成及Taqman探针的设计及合成由南京金斯瑞生物科技有限公司完成。2* EzWay™ Hot Taq PCR MasterMix购自上海拜力生物科技有限公司。采用10 μL的PCR反应体系：2* EzWay™ Hot Taq PCR Master Mix 5 μL，上游引物及下游引物(10 nmol/L)各0.5 μL，FAM、HEX探针(10 nmol/L)各0.25 μL，DNA模板1 μL，ddH2O 2.5 μL。扩增反应条件：95 ℃ 10 min预变性，95 ℃ 15 s变性，60 ℃ 1 min退火及延伸，共40个循环。PCR反应在ABI7900荧光定量PCR仪中进行，在ABI SDS 2.2软件中分析各位点的基因型。分别统计哮喘病例组和健康对照组各位点不同基因型的分布频率，并比较差异。
哮喘病例组所有患儿的治疗方案参照全球哮喘防治创议(GINA)指南[9]，按病情发展进行阶梯治疗。初始治疗均使用低剂量吸入性糖皮质激素(ICS)类药物联合短效β2－受体激动剂类药物治疗方案(SABA)，用药剂量由患儿病情严重程度决定；初始治疗满1个月后复诊，根据过去1个月内的平均药效维持时间、发病次数及程度等情况综合调整SABA的使用剂量(升高、维持或降低使用次数)，ICS用药剂量不变。统计不同基因型患儿剂量调整情况并比较差异。
采用蛋白质从头建模法工具QUARK(http：//zhanglab.ccmb.med.umich.edu/QUARK)[10]分析氨基酸序列变化前后蛋白质结构的变化，为避免所取序列过长容易湮没单一氨基酸突变带来的变化，因此，以突变点为中心取30个氨基酸左右的短序列进行建模。建模完成后比较突变前后的变化；利用生物信息学工具SMART(http：//smart.embl－heidelberg.de/smart/set_mode.cgi？)[11]分析ADRB2的结构域特性，并分析多态性位点所在区域可能的生物学功能。
采用SPSS 19.0统计软件进行统计分析，两样本均数比较采用t检验或秩和检验，基因遗传稳定性采用Hardy－Weinberg平衡定律检验，采用χ2检验比较2组间基因型的分布及等位基因的差异。对于单向有序的分类计数资料，组间两两比较采用Mann－Whitney检验，多组间比较采用非参数检验中的Kruskal－Wallis检验，P<0.05为差异有统计学意义。
rs1042713位点的多态性由A、G 2种核苷酸组成，即46位的核苷酸可能是A也可能是G，rs1042714位点的多态性由C、G 2种核苷酸组成，即79位的核苷酸可能是A也可能是G。按照等位基因及基因型频率的公式分别计算哮喘病例组和健康对照组rs1042713和rs1042714位点的不同基因型频率，结果见表1。且χ2检验发现，哮喘病例组和健康对照组中2个位点的基因型的实际频率与期望频率差异无统计学意义，即2组中rs1042713和rs1042714位点基因频率的分布符合Hardy－Weinberg平衡定律。
健康对照组及哮喘病例组儿童rs1042713和rs1042714位点的Hardy－Weinberg平衡定律检验
The test of Hardy－Weinberg equilibrium of rs1042713 and rs1042714 locus between the healthy control group and the asthma case group
健康对照组及哮喘病例组儿童rs1042713和rs1042714位点的Hardy－Weinberg平衡定律检验
The test of Hardy－Weinberg equilibrium of rs1042713 and rs1042714 locus between the healthy control group and the asthma case group
| 组别 | 基因型 | rs1042713 | χ2值 | P值 | rs1042714 | χ2值 | P值 | ||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| AA | AG | GG | CC | CG | GG | ||||||
| 健康对照组 | 实际频率(频数) | 48.8(81) | 41.6(69) | 9.6(16) | 0.043 | 0.979 | 71.1(121) | 21.1(35) | 7.8(10) | 3.977 | 0.137 |
| 预期频率 | 48.4 | 42.3 | 9.3 | 66.6 | 30.3 | 3.4 | |||||
| 哮喘病例组 | 实际频率(频数) | 32.9(57) | 45.7(79) | 21.4(37) | 0.182 | 0.913 | 61.3(106) | 28.9(50) | 9.8(17) | 2.105 | 0.349 |
| 预期频率 | 31.1 | 49.3 | 19.6 | 57.3 | 36.8 | 5.9 | |||||
2组基因型及等位基因的频率见表2、表3。经χ2检验发现，2组间rs1042713位点的基因型及等位基因频率差异有统计学意义(P<0.05)，而rs1042714位点的基因型及等位基因的频率差异无统计学意义(P>0.05)。
健康对照组及哮喘病例组儿童rs1042713位点基因型及等位基因频率比较
The comparison of the genotype frequency and allele frequency of rs1042713 locus between the healthy control group and the asthma case group
健康对照组及哮喘病例组儿童rs1042713位点基因型及等位基因频率比较
The comparison of the genotype frequency and allele frequency of rs1042713 locus between the healthy control group and the asthma case group
| 组别 | 基因型频率(%) | χ2值 | P值 | 等位基因频率(%) | χ2值 | P值 | |||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| AA | AG | GG | A | G | |||||
| 健康对照组 | 81(48.8) | 69(41.6) | 15(9.6) | 13.976 | 0.001 | 231(69.6) | 101(30.4) | 13.768 | 0.000 |
| 哮喘病例组 | 57(32.9) | 79(45.7) | 37(21.4) | 193(55.8) | 153(44.2) | ||||
健康对照组及哮喘病例组儿童rs1042714位点基因型及等位基因频率的比较
The comparison of the genotype frequency and allele frequency of rs1042714 locus between the healthy control group and the asthma case group
健康对照组及哮喘病例组儿童rs1042714位点基因型及等位基因频率的比较
The comparison of the genotype frequency and allele frequency of rs1042714 locus between the healthy control group and the asthma case group
| 组别 | 基因型频率(%) | χ2值 | P值 | 等位基因频率(%) | χ2值 | P值 | |||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| CC | CG | GG | C | G | |||||
| 健康对照组 | 118(71.1) | 35(21.1) | 13(7.8) | 3.680 | 0.159 | 271(81.6) | 61(18.4) | 3.513 | 0.061 |
| 哮喘病例组 | 106(61.3) | 50(28.9) | 17(9.8) | 262(75.7) | 84(24.2) | ||||
病例组患儿用药1个月后复诊时对SABA用药剂量调整的统计结果见表4。对于rs1042713位点基因型为GG的患者用药的调整与AA、AG基因型患者差异有统计学意义，即不同基因型患儿对SABA药物的反应性不同，rs1042713位点GG基因型的患者相对于其他基因型可能需要更高的用药剂量才能达到治疗目的，即可能具有一定耐药性。而rs1042714位点基因型为CC的患者复诊时药物剂量的调整与CG、GG基因型组差异不明显。
哮喘病例组rs1042713和rs1042714位点各基因型患儿SABA剂量调整情况
Basic statistics of use of SABA among the different genotype of rs1042713 and 1042714 locus in the asthma case group
哮喘病例组rs1042713和rs1042714位点各基因型患儿SABA剂量调整情况
Basic statistics of use of SABA among the different genotype of rs1042713 and 1042714 locus in the asthma case group
| 位点 | 基因型 | 是否调整用药剂量 | |||
|---|---|---|---|---|---|
| 降低 | 不变 | 提高 | |||
| rs1042713位点 | AA(1) | 29 | 20 | 8 | Z12＝1.132，P＝0.258 |
| AG(2) | 30 | 39 | 10 | Z13＝3.307，P＝0.001 | |
| GG(3) | 7 | 17 | 13 | Z23＝2.877，P＝0.004 | |
| H＝12.583，P＝0.002 | |||||
| rs1042714位点 | CC(4) | 20 | 69 | 17 | Z45＝1.648，P＝0.099 |
| CG(5) | 19 | 22 | 9 | Z46＝0.588，P＝0.556 | |
| GG(6) | 6 | 7 | 4 | Z56＝0.561，P＝0.575 | |
| H＝2.696，P＝0.260 | |||||
注：Z12表示rs1042713位点AA和AG型比较；Z13表示rs1042713位点AA和GG型比较；Z23表示rs1042713位点AG和GG型比较；Z45表示rs1042714位点CC和CG型比较；Z46表示rs1042714位点CC和GG型比较；Z56表示rs1042714位点CG和GG型比较 Z12 mean the comparison of AA and AG in rs1042713; Z13 mean the comparison of AA and GG in rs1042713; Z23 mean the comparison of AG and GG in rs1042713; Z45 mean the comparison of CC and CG in rs1042714; Z46 mean the comparison of CC and GG in rs1042714; Z56 mean the comparison of CG and GG in rs1042714
rs1042713位点的多态性引起肽链上第16个氨基酸Arg→ Gly变化，而rs1042714位点的多态性引起肽链上第27个氨基酸Glu→Gln的变化，局部建模结果见图1、图2。从图1中可以看出，当16位氨基酸为Arg时，短肽的三级结构为3个折叠并延伸的无规则卷曲，当为Gly时，多态性位点结构出现α－螺旋，且三级结构折叠角度较Arg时也有差异，说明该位点的多态性引起了蛋白局部结构的不同，从而有可能造成蛋白质功能的不同。从图2中可以看出，27位氨基酸无论是Gln还是Glu，其短肽的三级结构无明显变化，说明该位点的多态性对应的蛋白质局部结构可能无差异。因此，推测ADRB2基因rs1042713位点的多态性引起蛋白局部结构的变化进而引起蛋白功能的差异可能是该位点多态性与儿童支气管哮喘的易感相关的原因；而同样的，rs1042714位点多态性与该疾病易感不相关，也可能是因为其多态性并不影响蛋白的结构。对ADRB2蛋白进行SMART蛋白结构域分析如图3所示，可以看出，2个多态性位点均位于临近第1个跨膜结构域的"unknown region"。因此，推测多态性位点与支气管哮喘易感性相关的原因可能是结构变化带来的"unknown region"某些未知功能的变化，也可能是其对临近的跨膜结构域的功能产生了一定影响。另外，2种多态性位点不论蛋白局部结构改变与否，均与治疗耐药性有相关性，也提示局部蛋白结构的变化并非不同基因型患儿耐药性差异的原因。
注：A：第16个氨基酸为Arg时的蛋白结构图；B：第16个氨基酸为Gly时的蛋白结构图，红色圆圈标记处为第16个氨基酸的位置 A：the protein structure diagram of while the 16th amino acid was Arg; B：the protein structure diagram of while the 16th amino acid was Gly.The position of the 16th amino acid was marked by red circle
注：A：第27个氨基酸为Gln时的蛋白结构图；B：第27个氨基酸为Glu时的蛋白结构图，红色圆圈标记处为第27个氨基酸的位置 A：the protein structure diagram of while the 27th amino acid was Gln; B：the protein structure diagram of while the 27th amino acid was Glu.The position of the 27th amino acid was marked by red circle
ADRB2的编码区存在着9个遗传多态性位点，其中有4个位点的核苷酸多态性导致氨基酸序列的改变，分别使得编码的第16、27、34、164位氨基酸发生Argl6→Gly、Gln27→Glu、Va134→Met、Thrl64→Ile的改变，其中前2个突变发生的频率较高且研究比较广泛[12]。核苷酸序列第46位点(rs1042713，肽链第16位)及79位点(rs1042714，肽链第27位)的多态性不仅能引起β2－肾上腺素受体功能的改变，而且在一定程度上可能与哮喘的临床表型和药物治疗的反应性相关，但现有研究结论并不完全一致[13,14]。因此，尚未能确定ADRB2基因的多态性与哮喘发病及SABA反应性之间的关系。
李倩等[15]研究表明，Arg16Gly位点可能是哮喘发病的易患基因；陈敬林等[16]的Meta分析结果也表明ADRB2基因rs1042713位点多态性与中国儿童哮喘易感相关，且携带G突变增加了患哮喘病的风险；Birbian等[17]研究印度北方人群哮喘发现Gly16等位基因能降低哮喘的发病风险，Gln27Glu多态性与哮喘无关，与de Paiva等[18]研究结果相似。以上研究均提示rs1042713位点多态性与哮喘易感相关，而rs1042714位点与哮喘易感不相关。而Li等[19]Meta分析发现Arg16Gly多态性和Gln27Glu多态性与中国成人哮喘发病的风险无关，但能降低中国儿童哮喘的发病风险；Isaza等[20]研究发现Arg16Gly多态性和Gln27Glu多态性与哮喘易感性不相关；邱玉英等[21]研究发现ADRB2 rs1042713位点各基因型及等位基因在哮喘患者及对照组的分布无差异；Guo等[22]同样发现ADRB2 rs1042713位点多态性与青岛地区儿童哮喘易感不相关，均与上述研究结论不一致。造成ADRB2基因位点多态性与哮喘相关性研究结果不完全一致的原因可能是：(1)不同地域、不同种族人群遗传背景不同；(2)病例收集的不同或样本容量的大小；(3)该位点的多态性与其他位点多态性的相互作用；(4)哮喘是多基因遗传病，存在遗传异质性；(5)环境因素[23]。因此，此类研究应局限于某一地区或某一种族来进行，比较不同地区或不同研究人群研究结果之间的差异并不是很大。本研究结果显示，ADRB2基因rs1042713位点的各基因型及等位基因的频率在哮喘病例组和健康对照组中差异有统计学意义，而rs1042714位点的基因型及等位基因的频率在2组间的分布无明显差异，该结果提示ADRB2基因rs1042713位点多态性与儿童哮喘相关，而rs1042714位点多态性与其不相关。同时等位基因对应的氨基酸序列建模结果也发现，rs1042713位点的多态性对应的蛋白二级及三级结构差异有统计学意义，而rs1042713位点的多态性对应的蛋白结构基本无变化，推测可能是由于蛋白结构的变化导致rs1042713位点多态性与儿童支气管哮喘相关，从生物信息学方面也进一步验证了上述结论。
ADRB2与哮喘发病有密切的关系。β2－受体激动剂作为治疗哮喘的药物，可选择性作用于β2－肾上腺素受体(偶联G蛋白膜受体)，激活腺苷酸环化酶(AC)，使细胞内cAMP增加，cAMP进一步磷酸化蛋白激酶，促进底物磷酸化，使得平滑肌松弛，解除支气管痉挛等症状[24]。因此，推测ADRB2基因多态性可能一定程度上影响机体对药物的耐受性。已有研究发现，ADRB2氨基酸第16位和27位的遗传多态性可能与β2－受体激动剂介导的受体下调、脱敏相关。内源性儿茶酚胺促进纯合型Glyl6和Glu27的受体下调，且16位点的多态性起主导作用[25]。本研究发现，rs1042713位点不同基因型对药物的反应性不同，GG基因型(Glyl6)的患者用药一段时间后，需要增加药物的剂量来抵抗受体的下调，缓解病情；但尚未发现rs1042714位点与药物的耐受性相关。这可能是由于蛋白结构及功能的变化造成的，也可能是由于多态性位点连锁不平衡的存在，其影响耐药性的机制尚需要进一步研究。
本研究发现ADRB2基因rs1042713位点多态性不仅与哮喘的易感相关，也在一定程度上影响哮喘对治疗的反应性，而rs1042714位点多态性与哮喘易感性和治疗反应性均不相关，其基本的机制可能是不同多态性位点上不同基因型对应的局部蛋白结构和功能的不同。本研究的不足之处在于，因ICS的初始剂量一致，且所有患儿依从性良好，未考虑到ICS使用依从性的差异对治疗反应性的影响，可能会造成位点多态性与治疗反应是否相关这一结果具有一定的偏倚性。同时由于本研究受时间及研究对象样本量的限制，不能完全阐明该多态性位点与哮喘临床表型的关系，需要进一步深入分析多基因或单基因多位点的交互作用及遗传学改变与环境的交互作用，更深入和全面地揭示哮喘的发病机制。
