探讨出生后发育关键期低质量浓度砷暴露对大鼠学习记忆的影响及其可能机制。
构建幼年大鼠脑快速发育期(出生4～10 d)水砷暴露模型。实验分为4组(每组10～12只)：正常对照组、15 μg/L三氧化二砷(As2O3)组、30 μg/L As2O3组、45 μg/L As2O3组。应用水迷宫实验进行学习记忆能力测试。采用HE染色、尼氏染色检测砷暴露后不同时间点海马CA1～CA3区和齿状回dentate gyrus(DG)神经元结构，免疫组织化学法检测微管相关蛋白Doublecortin(DCX)，了解海马神经元的生长发育水平。
与正常对照组比较，砷暴露组大鼠逃避潜伏期延长，正常对照组、15 μg/L As2O3组、30 μg/L As2O3组、45 μg/L As2O3组大鼠第5天平均逃避潜伏期分别为(17.00±9.53) s、(35.89±19.81) s、(26.60±18.84) s、(33.79±18.08) s，组间比较差异有统计学意义(F＝3.591，P<0.05)，在原目标象限停留时间缩短，分别为(38.93±8.33) s、(36.03±16.25) s、(29.85±9.27) s、(29.84±10.16) s，组间比较差异无统计学意义(F＝1.681，P＝0.187)。HE染色和尼氏染色显示：急性期砷暴露大鼠海马CA1区、CA2区及齿状回细胞出现水肿、变性、坏死等病理改变，砷暴露质量浓度越高，细胞结构紊乱越明显。但暴露后5周检测发现，砷暴露组海马神经元病理改变逐渐恢复正常。免疫组织化学显示：砷暴露后24 h，与对照组比较，砷暴露大鼠CA1区、CA2区及齿状回DCX表达明显减少，其中45 μg/L As2O2组最为明显。砷暴露后5周，海马CA1～CA3区各组均无表达，齿状回仍有少量表达。
出生后发育关键期低质量浓度砷暴露可影响大鼠的学习记忆，大鼠海马齿状回神经元的生发异常可能为其潜在机制。
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砷污染是一种常见的重金属污染，世界卫生组织(WHO)公布全球目前至少有2亿人受砷污染的威胁，主要集中在亚洲国家，如印度、孟加拉及中国[1,2,3]。砷污染以饮用水型砷污染最常见，流行病学调查显示：妊娠或出生后发育关键期的砷暴露可导致婴幼儿认知和行为异常[4,5]，这说明砷暴露可影响未成熟大脑发育及神经网络构建[6]，严重影响患儿成年后的生活质量。动物实验表明文献报砷暴露可导致小鼠的操作性学习获得时间延长，砷剂量相关的操作性学习缺陷[7,8]，且有文献证实，未成熟脑对砷暴露更为敏感[9]。
既往针对砷暴露对群体健康的影响主要集中在高质量浓度砷暴露(水砷浓度>50 μg/L)。近年来低质量浓度暴露(<50 μg/L，接近WHO推荐的安全水砷质量浓度10 μg/L)对群体健康的影响引起了人们的广泛关注[10,11]。但发育关键期低浓度砷暴露对认知和学习记忆的影响及其机制仍不清楚。
本课题组前期体外实验证实砷暴露可影响神经元的迁移能力，降低与神经元迁移和生发能力密切相关的微管相关蛋白doublecortin (DCX)的表达[12,13]。但砷暴露体内实验是否可影响神经元DCX的表达尚不清楚，亟待研究。因此，本研究通过建立大鼠出生后早期砷暴露大鼠模型，采用水迷宫实验和探索行为测试实验观察大鼠空间学习记忆能力及探索行为的变化，并进行不同时间点的大鼠海马HE染色、尼氏染色与DCX免疫组织化学染色，分析早期低质量浓度砷暴露对大鼠学习记忆能力、探索能力、海马神经元的形态及DCX表达的影响，并探讨它们之间的关系。
SD大鼠孕鼠购自贵州医科大学动物实验中心(合格证号：SCXK黔〔2012-0001〕)，雌雄不限，出生后4 d幼鼠44只建立三氧化二砷(As2O3)水砷暴露模型。砷暴露组幼鼠，每天早上8点、晚上8点使用微量注射器灌胃不同质量浓度的As2O3，直至出生后10 d；正常对照组给予灌注同等剂量的蒸馏水。
根据WHO推荐的安全水砷质量浓度10 μg/L。参照动物《药理实验方法学》计算公式，大鼠暴露剂量(mg/kg)＝W×人的剂量(mg/kg)，W系数为6.25[14]，得出大鼠安全水砷暴露质量浓度上限剂量为10.5 μg/L。因此，将砷暴露浓度设为15 μg/L(12只)、30 μg/L(12只)、45 μg/L(10只)，砷暴露组给予不同质量浓度As2O3水喂养，正常对照组(10只)给予正常喂养。
出生后6周左右(砷暴露后4周)，使用Morris水迷宫评估进行学习和记忆能力测试。将大鼠头朝池壁放入水中，放入位置随机取4个象限中的任何一个象限作为起始位置。记录动物找到水下平台的时间(s)。在前几次训练中，如果超过120 s大鼠仍未找到平台，则引导大鼠到平台上停留10 s。每只动物每天训练4次，2次训练之间间隔15～20 min，连续训练5 d。第6天将平台撤除，开始120 s的探查训练。将动物由原先平台象限的对侧放入水中。记录动物在目标象限(原先放置平台的象限)所花的时间和进入该象限的次数，以此作为空间记忆的检测指标，记录训练期间逃避潜伏期[15]。
将被测大鼠放入铺满新垫料的木质箱子内(长66 cm×宽57 cm×高40 cm)，箱子2个相邻的侧壁分别有2个和3个孔洞，记录3 min内大鼠垫脚并用鼻子嗅侧壁孔洞的次数。探索行为是动物对新环境新刺激表现出的兴奋行为，体现了动物对新行为的获得与发展、保持与再现的应激能力[16]。
在出生后11 d(砷暴露后24 h)、17 d(砷暴露后1周)、24 d(砷暴露后2周)、45 d(砷暴露后5周)，常规石蜡切片，二甲苯脱蜡、梯度乙醇脱苯，Harris苏木精染核，10 mL/L盐酸乙醇返蓝，至水洗，入10 mL/L伊红水溶液染色，梯度乙醇脱水，二甲苯透明后封片镜检，镜下观察海马病理形态学变化。
在出生后11 d、17 d、24 d、45 d，石蜡切片脱蜡至水，37 ℃在焦油紫染液中染色10 min，蒸馏水洗，采用950 mL/L乙醇分化至尼氏体为紫色，然后脱水、透明、封片，采用显微图像分析系统观察。
在出生后11 d、17 d、24 d、45 d，经脱蜡、梯度脱水、抗原修复(DCX采用微波修复)，30 mL/L H2O2去离子水灭活内源性过氧化物酶，正常山羊血清封闭，加入一抗兔多克隆DCX抗体(1 500) 4 ℃孵育过夜，37 ℃复温45 min，按链霉亲和素-生物素复合物(SABC)法完成免疫组织化学染色(中杉金桥免疫组织化学试剂盒)，苏木素复染，盐酸乙醇分化，梯度脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。每只鼠选取2张切片，每张切片海马各区分别选取2个400倍视野，应用Image-pro plus 6.0图像分析软件测定平均吸光度值。
采用SPSS 21.0统计软件对数据进行统计学分析，计量资料以
±s表示，多组间的比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。
Morris水迷宫检测发现各组大鼠逃避潜伏期在第1、2、3、4天组间比较差异均无统计学意义(P>0.05)，训练第5天砷暴露逃避潜伏期均明显延长(P<0.05)(图1)。空间探索实验中砷暴露组大鼠通过平台的次数与正常对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)，砷暴露组大鼠在靶象限的时间比对照组减少，30 μg/L和45 μg/L组与正常对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)(表1)。砷暴露组大鼠探索次数与正常对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)(表1)。
各组大鼠海水迷宫空间探索实验及探索行为的变化比较(
±s)
Spatial exploration experiment of water maze and exploration behavior of rats changes in each group(
±s)
各组大鼠海水迷宫空间探索实验及探索行为的变化比较(±s)
Spatial exploration experiment of water maze and exploration behavior of rats changes in each group(±s)
| 组别 | 例数 | 跨越平台次数 | 靶象限停留时间 | 嗅侧壁孔洞次数 |
|---|---|---|---|---|
| 正常对照组 | 10 | 10.54±3.71 | 38.93±8.33 | 7.33±3.34 |
| 15 μg/L组 | 12 | 10.80±3.52 | 36.03±16.25 | 6.10±3.57 |
| 30 μg/L组 | 12 | 11.64±3.79 | 29.85±9.27a | 6.21±2.81 |
| 45 μg/L组 | 10 | 12.50±3.09 | 29.84±10.16a | 5.83±2.62 |
| F值 | 0.888 | 1.681 | 0.553 | |
| P值 | 0.455 | 0.187 | 0.649 |
注：与对照组比较，aP<0.05 Compared with the control group，aP<0.05
HE染色结果显示，砷暴露后24 h，正常对照组大鼠海马各区神经元排列整齐，紧密，细胞形态完整，30 μg/L和45 μg/L组大鼠海马CA1区、CA2区，齿状回细胞水肿，变性，坏死，细胞层次絮乱，排列松散，大量神经细胞核膜不清，胞质深染，胞核固缩为三角形或多角形。砷暴露后1周，30 μg/L和45 μg/L组大鼠海马CA1区病理改变减轻，但CA2区，齿状回仍有明显的病理改变。砷暴露后2周，神经元胞体肿胀减轻，各项病理改变均有不同程度的改善。砷暴露后5周，海马各区HE染色显示，各组均未见明显的病理改变(图2)。
尼氏染色结果显示，砷暴露后24 h，对照组海马各区神经元排列整齐且密集，形态规则，胞质中尼氏体丰富致密。15 μg/L组海马神经元排列相对规则，大部分神经元呈圆形或椭圆形，胞质中尼氏体轻度减少。30 μg/L和45 μg/L组CA1区，CA2区，齿状回海马神经元絮乱而稀松，神经元脱失，形态不规则，呈三角形或多边形，核仁不明显，胞质中尼氏体减少。砷暴露后1周，15μg/L组各区海马神经元已基本恢复正常，但30 μg/L组及45 μg/L组大鼠CA2区及齿状回神经元数量仍减少。暴露后2周，45 μg/L组大鼠CA2区神经元细胞少于对照组，其余均无明显影响。砷暴露后5周各组大鼠海马神经元均无明显差异(图3)。
免疫组织化学显示，对照组大鼠海马各区DCX随年龄增加而表达明显减少，其中齿状回表达最多。砷暴露后24 h，与对照组相比，砷暴露组大鼠CA1区，CA2区，齿状回DCX表达明显减少，正常对照组、15 μg/L As2O3组、30 μg/L As2O3组、45 μg/L As2O3组大鼠海马CA1区吸光度分别为0.061±0.009，0.045±0.013，0.042±0.007，0.045±0.010，组间比较差异有统计学意义(F＝5.717，P<0.01)。大鼠海马CA2区吸光度值分别为0.051±0.004，0.046±0.003，0.036±0.008，0.033±0.013，组间比较差异有统计学意义(F＝7.506，P<0.01)。大鼠海马DG区吸光度值分别为0.061±0.006，0.054±0.010，0.046±0.013，0.039±0.012，组间比较差异有统计学意义(F＝6.271，P<0.01)。砷暴露后1周，砷暴露组大鼠CA1区，CA2区DCX表达仍明显少于对照组，45 μg/L As2O3组最明显。CA1区各组吸光度值分别为0.025±0.002，0.022±0.003，0.021±0.004，0.015±0.005，组间比较差异有统计学意义(F＝8.869，P<0.001)，CA2区各组吸光度值分别为0.038±0.003，0.036±0.008，0.026±0.011，0.025±0.012，组间比较差异有统计学意义(F＝4.332，P<0.05)。齿状回表达也低于对照组，但差异无统计学意义。砷暴露后2周，与正常对照组相比，砷暴露组海马各区DCX表达无明显差异。砷暴露后5周，海马CA1～CA3区各组均无表达，齿状回仍有少量表达(图4)。
大鼠出生4～10 d相当于人类从妊娠晚期到婴儿早期这一阶段，该阶段为大脑的快速发育阶段[17]。本研究通过建立大鼠生后4～10 d低质量浓度水砷暴露，结果发现大脑的快速发育阶段低浓度砷暴露可导致大鼠学习能力降低。HE染色、尼氏染色可见短期内期海马结构紊乱，且CA2区和齿状回病理改变最为明显，随着时间的推移，相应的病理改变逐渐恢复。免疫组织化学染色发现，暴露后24 h，与正常对照组比较砷暴露组大鼠海马CA1，CA2，齿状回DCX表达明显减少，至砷暴露后5周，仅齿状回少量表达。
WHO推荐的标准水砷质量浓度为10 μg/L，一项回顾性研究表明，即使低于现行安全准则，暴露量也与智力功能的下降有关[11]。研究发现发育中的大脑可能更容易受到砷的神经毒性作用。即使在没有暴露100 d的康复期之后，大鼠仍然表现出学习障碍，这一发现表明不可逆转[18]。本研究也发现既即使在没有暴露28 d的康复期之后，大鼠仍然表现出学习障碍。研究发现砷暴露大鼠后代对新异性的反应方面有缺陷[18]。本研究结果对探索行为的影响不明显可能与重金属损害呈浓度依赖性有关。
各种各样的环境危险因素作用于发育期的神经元，可导致神经元出现病理改变，如尼氏小体消失。本研究发现大脑快速发育期低浓度砷暴露后短期可见海马神经元结构受损，生后6周恢复正常。这说明低质量浓度砷暴露导致的神经元病理改变是可逆的。免疫组织化学检测发现，急性期海马神经元DCX表达明显减少，然而生后45 d，海马齿状回神经元DCX表达恢复。研究结果表明急性期海马神经元神经生发能力降低，而后期海马齿状回神经生发能力是可恢复的。有文献报道成年大鼠神经元产生主要在海马齿状回的颗粒下区dentategyrus(DG)和侧脑室的脑室下区subventricular zone (SVZ)，在齿状回新增殖祖细胞迁移到颗粒细胞层，分化为成熟的神经元和轴突突起延伸到CA3等区域[19,20]。研究发现中枢神经系统急性损伤会诱发大脑中的神经祖细胞增殖，成年沙鼠在全脑缺血10 min后2周，齿状回中新生神经元细胞开始增加[21]，且Winkelheide等[22]发现轻度缺血性损伤较严重的缺血性损伤更能刺激神经发生。但SVZ和DG中新产生的神经元细胞在缺血后大脑中的成熟非常缓慢，增殖祖细胞在数天内表达未成熟的神经标志物，如DCX和Ki67，缺血数周后开始表达成熟的神经标志物，如NeuN和BrdU[23,24]。本研究结果结合既往的文献报道说明海马病理结构的恢复可能是一种神经系统适应性的补偿过程。DCX是在迁移和分化中的神经元上表达的一种微管相关蛋白，其主要表达在迁移中的神经元胞体和前导突起上以及分化中的神经元轴[25,26]。DCX等位基因的突变将影响皮质发育过程中神经元前体细胞的迁移，从而导致无脑回畸形、智力发育障碍和癫痫等皮质发育异常性疾病[27,28]。研究显示DCX可能是通过调节微管的结构和稳定性来指导神经元的迁移[29]。本组前期体外实验研究发现：砷暴露可降低微管相关蛋白DCX的表达减弱皮层神经元迁移[12,13]，虽然后期齿状回海马神经元神经生发增强可修复砷暴露致神经元病理改变，然而新生的神经细胞成熟缓慢，尚未形成正确的突触联系。因此，后期海马神经元齿状回神经元生发异常可能是低质量浓度砷暴露致学习障碍的潜在机制。
综上所述，本实验通过构建快速发育期低质量浓度砷暴露模型，发现出生后发育关键期低浓度砷暴露可影响大鼠的学习记忆，海马齿状回神经元的生发异常可能为其潜在机制。
所有作者均声明不存在利益冲突
