急性呼吸道感染是儿童常见的感染性疾病，快速准确地确定病原体，进而早期进行针对性治疗，对预后至关重要。因此，采取灵敏有效的检测方法是病原学诊断的关键。现就儿童呼吸道病原检测方法的应用及研究进展进行综述。
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急性呼吸道感染作为儿童最常见的感染性疾病之一，可引发急性上呼吸道感染、急性支气管炎、毛细支气管炎、肺炎等多种疾病，也是目前5岁以下儿童最主要的死亡原因之一[1]。引起急性呼吸道感染的病原谱十分复杂，常见病原体包括细菌、真菌、病毒和非典型病原等。由于受检验方法的限制，以往儿童急性呼吸道感染的病原学诊断多局限于单一病原的检测，但随着病原学诊断方法的改进和创新，多重病原体混合感染的报道也在逐年增多[2]。近年来，随着生物技术的发展，各种新型的呼吸道病原体检测技术为疾病治疗、流行病学调查及疫情控制提供了有力支持，基于此，现对相关病原检测的应用及研究进展作一综述。
作为诊断的金标准，分离培养法是呼吸道病原学最经典也是最常用的检测方法，其优点是可检测多种病原，甚至鉴定新的病原种类，并同时结合药敏结果，从而更有效地给予临床治疗的指导。呼吸道样本通常使用样本刷、肺泡灌洗或气管吸痰术采集，目前认为病原生长浓度在3种方法下分别达到1×106 CFU/L、1×107 CFU/L和1×108 CFU/L时，则提示可能感染。但有研究表明，即使病原菌的增长量低于该阈值，如有长期抗生素应用使培养的敏感性降低等情况，也不能排除感染[3]。但培养法因其操作过程复杂、周期长而无法进行快速诊断，同时因某些病原培养条件苛刻，分离阳性率低及对标本采集、运送要求较高，而限制了其临床运用。
病原学的血清学检测方法主要包括酶联免疫吸附试验(ELISA)、免疫荧光检测(IF)、免疫印迹法、免疫胶体金法、补体结合试验、微量凝集法等，是诊断呼吸道病原体感染后患者免疫状态的方法之一。对于无法采集痰标本进行培养的患儿，以及在传统培养基中不易生长的非典型病原体感染，该方法具有一定的优越性。由于机体发生感染后产生免疫球蛋白(Ig)G抗体较晚，但在体内维持时间较长，因此IgG抗体的检测主要用于原发性感染的回顾性诊断和流行病学调查，若要确定近期感染，需通过IgM检查筛选，双份血清抗体效价4倍以上增高有诊断意义。但临床上较难采集双份血清进行检测，单份血清结果往往不能真实地反映患儿感染情况。虽然血清IgM类抗体出现早于IgG抗体，但免疫力低下患儿或2岁以下的婴幼儿因免疫系统发育不全，感染后抗体不产生从而会导致假阴性[4]。因此该方法对早期诊断及早期临床用药指导仍有一定局限性。目前临床上较常应用的检测手段为呼吸道9项病原体IgM抗体的间接免疫荧光试剂，包括腺病毒(ADV)、呼吸道合胞病毒(RSV)、甲型流感病毒(IFVA)、乙型流感病毒(IFVB)、副流感病毒(PIV)、嗜肺军团菌、肺炎支原体(MP)、Q热立克次体、肺炎衣原体(CP)[5]，适合各级医院对于常见呼吸道病原体进行快速检测。
抗原检测方法是采用针对病原的特异性抗体，通过酶免疫法(EIA)、免疫荧光抗体(FA)等免疫方法检测病毒抗原，适用于血清型较少、细胞培养不能增殖的呼吸道病原。目前临床上常用的直接免疫荧光法(DFA)是直接将标记有荧光素的已知抗体与细胞或组织中的相应抗原反应，通过检测呼吸道分泌物如痰液、支气管肺泡灌洗液、胸水及肺组织等标本的病原体抗原发现病原体，该方法尤其适用于富含宿主细胞的标本。其用时短，操作简便，特异性高，且不需要复杂的操作仪器，不要求标本中存在完整菌株，有利于检测人员开展工作，是当前众多实验室呼吸道病毒检测的主流方法[6,7]，即使已经应用抗生素治疗的患儿仍可检出病原菌[8]。但该方法也存在敏感性偏低，且每检查一种抗原就需要制备一种荧光抗体等不足，如从临床标本中检测嗜肺军团菌，虽然特异性高达95%～100%[9]，但其敏感性只有25%～75%[8]。另外，由于特异性抗体与不同抗原间的交叉反应可能引起假阳性，因而此方法在临床诊断中的应用价值有限。
PCR法是一种高效快捷、操作简单且成本低的新技术，其原理是在体外模拟体内DNA复制的核酸扩增过程，可以对多种病原体同时进行检测，因而在混合感染的病原学诊断上具有独特的优势和极高的临床应用价值，近年来逐渐成为临床病原体检测的重要分子检测方法。该方法可用于鼻咽和口咽分泌物、痰液、胸水、支气管肺泡灌洗液、活检肺组织等多种标本的检测，与传统检测方法相比，其敏感性高、特异性好，亦不受抗生素的影响，对于病原菌的早期临床诊断有重要作用。李春香等[10]对先天性心脏病术后患呼吸机相关性肺炎的患儿分别进行深部呼吸道分泌物的定量培养和PCR检测，发现传统法培养经72 h培养后，病原检出的阳性率为39.2%，而PCR法24 h阳性率为65.3%，其敏感性及特异性均高于培养法。但PCR技术需要规范的操作和严格的质量控制，易因非特异性反应而使结果呈假阳性，且不能反映药物敏感性或耐药性等，在是否耐药和最小抑菌浓度等方面并不能取代传统培养法。
RT－PCR技术是指在反应体系中加入荧光基团或荧光染料，利用反应中发出的荧光信号的不断累积实时监测整个PCR进程，继而通过绘制的标准曲线对未知模板进行定量分析的一种方法。大部分呼吸道细菌的RT－PCR方法已建立，如通过该方法从临床标本中检测肺炎链球菌，敏感性及特异性均为100%，且整个检测过程仅需2 h[11]。同样，RT－PCR方法对MP检测也有较高的敏感度和特异度，分别为100.0%和95.4%[12]。王林等[13]对1 025例流感样病例标本分别采用RT－PCR和细胞分离培养法检测流感病毒，结果显示，RT－PCR和细胞培养检测流感病毒核酸阳性率分别为26.63%、12.58%(χ2＝64.165，P<0.05)。可见，相较于传统的细胞分离培养法，RT－PCR方法对流感病毒检测具有更高的灵敏性，且检测速度快，可作为一种快速有效的流感病毒核酸检测法，尤其适用于公共卫生应急疫情的实验室快速诊断。另外，近年来商品化的RT－PCR检测平台在临床的应用中也越来越广泛。作为独特的RT－PCR系统，结核分枝杆菌及利福平耐药快速检测(Xpert MTB/RIF)可以直接从原始痰标本中快速、敏感地检出结核分枝杆菌及利福平耐药性[14]。北京儿童医院对儿童肺结核患者的气管肺泡灌洗液进行Xpert MTB/RIF检测，结果显示抗酸涂片、结核菌培养及Xpert MTB/RIF的敏感性分别为8.4%、28.9%和53.0%，特异性均为100.0%，表明用支气管肺泡灌洗液进行Xpert MTB/RIF检测能快速诊断儿童肺结核[15]。目前，与其他分子生物学技术相结合的RT－PCR技术使极微量的病原体基因表达或DNA拷贝的定量分析成为可能，但与传统的PCR技术相比，此方法的封闭式检测过程减少了扩增后电泳的检测步骤，因此无法获悉扩增产物的具体大小。另外，多重检测的进一步应用也受限于荧光种类及检测光源[16]，且其高昂的检测费用在很大程度上影响了临床推广，因而还需对费效比进行界定[17]。
多重PCR又称多重引物PCR或复合PCR，其原理、反应试剂和操作过程均与普通PCR相似，但可在同一PCR反应体系里加入2对或2对以上引物，从而在一次反应中同时扩增出多个核酸片段。可见，多重PCR方法能同时检测多种病原体，在临床混合感染的鉴别诊断上具有独特的优势和较高的实用价值[18,19]。目前，多重PCR的发展已较为成熟，对多种病原微生物检测均具有较高特异性和敏感性，其研制周期和成本也明显低于RT－PCR和基因芯片，并且操作步骤简单，更有利于在临床广泛应用。Thong等[20]建立了能同时检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、鲍曼不动杆菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌的多重PCR检测方法，其敏感性和特异性可达100%。Mo等[21]研发的一步法多重反转录PCR方法可对A型、B型和新型甲型H1N1流感病毒进行快速筛查，与RT－PCR结果比较，二者对50份盲法实验评价样本的检测结果的总体符合率达100%。上海儿童医学中心[22]在1年内从急性呼吸道感染患儿中收集了775份呼吸道标本，使用FilmArray呼吸道测试条(FilmArray Respiratory Panel，FilmArray RP)检测，阳性率达80.8%，其中单一病原体感染率55.2%，混合感染达25.5%，人鼻/肠病毒是最常见的病原体(25.5%)，其次是RSV(19.5%)和PIV 3(14.8%)。FilmArray不同于传统的多重PCR，该系统包括自动核酸提取、初始反转录和多重巢式PCR步骤，最后进行熔解曲线分析并自动生成报告[23]，整个过程都在密闭管中进行，污染风险小，只需要2 min的加样时间和65 min的反应时间，可快速获得检测结果，有助于患者的分诊及管理[24]。FilmArray RP可检测ADV、冠状病毒HUKI/OC43/229E/NL63(CoV－HUKI/OC43/229E/NL63)、IFVA、IFVB、PIV1～4、人偏肺病毒(HMPV)、人鼻/肠病毒(HR/EV)、RSV、CP、MP和百日咳杆菌(BP)。有研究选取临床疑似百日咳的患儿71例行FilmArray检测，提示40.8%的患儿BP感染，其痉挛性咳嗽程度、白细胞计数及淋巴细胞比例明显高于类百日咳组，建议对于疑似百日咳的患儿进行FilmArray联合培养检查，以便更好地用于疫情数据的监测[25]。
LAMP依赖一种链置换DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)，通过设计识别目的片段6个序列的4个特异引物对特异病原体的核酸进行检测。与传统PCR方法不同，LAMP在反应过程中简化了94 ℃的变性步骤，同时退火和延伸在相同温度条件下(60～65 ℃)进行，整个反应可以在恒温条件下完成。另外，完成整个LAMP的反应历时短，一般30～60 min即可判断结果，反应结果可直接靠扩增副产物焦磷酸镁的沉淀度进行判断，是一种全新的快速诊断核酸扩增方法。Hoos等[26]开发并评估了基于反转录环介导等温扩增(RT－LAMP)对RSV的检测，该方法可在30 min内检测RSV且无需提取RNA。结果显示，与RT－PCR相比，RT－LAMP对鼻咽试纸标本中RSV检测的敏感性为70%～80%，与目前临床常规使用的病毒快速抗原检测方法(RADT)相当，但成本仅为RADT的10%。Zhang等[27]首次将多重PCR与LAMP相结合，并成功应用于8种常见呼吸道病原体的检测。对于真菌的检测，PCR检测出副球孢子菌特异的基因(gp43和gp27等)通常需5～6 h，在血液或组织标本中甚至需要12 h以上，而Endo等[28]利用LAMP方法检测gp43基因仅需3 h。LAMP法还可从经石蜡包埋的组织样本中抽提病原体DNA为模板进行鉴定，在真菌的临床检测中有较好的应用前景。
NGS又称高通量测序技术，是不依赖于传统微生物培养方法而明确样本中所有微生物分类及功能的检测技术[31,32]。NGS无需事先对样本进行特异性扩增，且能够无偏倚地在同一样本中同时检测已知或者未知的细菌、真菌、寄生虫和病毒，还能明确微生物的抗生素耐药情况。在未知病原菌的感染性疾病暴发调查、传统检测结果阴性的感染患者、免疫缺陷患者及危重症感染患者的应用中均已证明了NGS的独特优势[33]。Langelier等[34]运用NGS方法检测了22例因下呼吸道感染入院的骨髓移植患者的支气管肺泡灌洗液，结果证实急性呼吸道感染的骨髓移植患者肺部存在人冠状病毒、轮状病毒、人疱疹病毒－6型、巨细胞病毒、单纯疱疹病毒、EB病毒、人乳头瘤病毒及扭矩特诺病毒等多种病毒，另存在少见的致病性细菌如轻型链球菌及棒状杆菌，且细菌与病毒共存患者的临床症状明显较重。Moran Losada等[35]运用NGS技术检测不同年龄阶段的囊性肺纤维化患者的痰液样本，结果表明呼吸道微生物主要由数百种细菌组成，其中金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌占绝对优势，而鉴定出的10种真菌和病毒仅占呼吸道微生物的1%左右，真菌主要为念珠菌和曲霉菌，病毒主要为ADV和疱疹病毒。该研究同时明确了每例呼吸道样本中每种微生物的丰度，并证实铜绿假单胞菌及金黄色葡萄球菌的抗生素耐药基因，为抗生素的精准选用提供了依据。目前NGS虽已经应用于临床，但由于各实验室对样本处理的试剂耗材各异，采用的测序平台不一，生物信息分析对照数据库也不同，因此需要大规模的多中心临床试验来制定统一的质控标准及检测流程[31]。
CRISPR技术因能高效地敲除及插入基因，被誉为"基因魔剪"，其在疾病治疗中的应用受到广泛关注。近年来，CRISPR技术在临床检测上的应用也进入人们的视线。2018年，Science杂志在同一期中刊登了4篇关于CRISPR技术在临床诊断相关应用的文章。Chen等[36]首次创建了一种名为DNA Endonuclease Targeted CRISPR Trans Reporter(DETECTR)的方法，实现了DNA检测的超高灵敏度，能够快速、专一地检测患者样本中的特定病毒。有学者开发了名为SHERLOCK(特定高敏感性酶解报告系统)的平台和HUDSON(加热未提取的诊断样品以消除核酸酶)检测病毒新型方法，将等温预扩增与CRISPR相关蛋白13组合起来检测单个RNA或DNA分子。该技术可从患者体液或其他样本(如呼吸道样本、粪便等)检测出微量的病原菌，所需时间不到2 h[37,38]。由于操作简便，敏感性高，且成本较低，该方法在临床检测中具有重要的应用前景。
综上，呼吸道病原检测方法种类繁多，每种检测方法都有其各自的优缺点。在具体应用中，应根据呼吸道病原体的特性及流行病学特点，采用多种检测方法联合使用的策略，以降低假阴性和假阳性结果，提高检测的特异性和敏感性，实现病原体的多元化快速简便检测。
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