探讨广州地区先天性甲状腺功能减低症(CH)患儿DUOX2基因变异及其临床表型特点。
广州市新生儿筛查中心对2015年4月1日至9月30日出生的108 899例新生儿进行CH筛查，确诊CH 83例，其中52例疑似甲状腺素合成障碍性CH(SDH)患儿进行了DUOX2变异热点区域(11个外显子)测序分析，随访3年。选择2011年至2012年确诊并进行DUOX2基因测序分析的96例SDH患儿为对照，比较不同时期CH患病率、DUOX2变异检出率及其临床特征。
1．CH总体患病率2015年为1∶1 312，其中SDH占73.5%(61/83例)，与2011年至2012年比较，CH患病率增高(1∶1 312比1∶2 779)，差异有统计学意义(P<0.001)，SDH所占比例差异无统计学意义(73.5%比76.6%，P＝0.593)。2.共52例SDH患儿进行了DUOX2热点区域测序，其中27例(51.9%)检出双等位基因变异(6例)或单等位基因变异(21例)，发现1个可能致病新变异p.S1091F。无义突变p.K530X占已检出变异位点的51.5%(17/33位点)，涉及16例(30.8%)SDH患儿。SDH患儿DUOX2变异检出率、突变谱特征与2011年至2012年比较，差异均无统计学意义(均P>0.05)。3.DUOX2无变异组与DUOX2变异组患儿新生儿干血斑促甲状腺素(bsTSH)、确诊时血清TSH(sTSH)、游离甲状腺素(FT4)及甲状腺球蛋白水平差异均无统计学意义(均P>0.05)。27例DUOX2变异患儿中，24例(88.9%)为暂时性CH，3例为永久性CH。
广州地区CH患病率呈增高趋势，51.9%的SDH患儿可检出DUOX2热点变异，临床转归以暂时性CH为主。p.K530X为最常见变异。
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先天性甲状腺功能减低症(CH)是由于甲状腺分化、迁移、发育异常，或参与甲状腺素合成的基因缺陷，导致甲状腺素不足，从而引起儿童体格及智力发育障碍，是最常见的内分泌疾病。近年来研究显示，CH的患病率呈上升趋势，以疑似甲状腺素合成障碍性CH(SDH)增高为主，占33%～72%[1,2,3]。本课题组对2011年至2012年确诊的CH患儿回顾性研究结果显示，DUOX2基因变异在SDH患者中占62.5%，且92.0%的变异位点出现在外显子5、6、9、14、17、20、25、27和28[4]。本研究对广州市2015年4月1日至9月30日出生经新生儿筛查确诊的SDH患儿进行DUOX2变异热点区域测序分析，并以2011年至2012年96例SDH患儿DUOX2全外显子及其相邻内含子测序结果进行对照分析，探讨DUOX2基因变异在广州地区CH发病中的致病作用及其临床表型特征。
广州市新生儿筛查中心对辖区内150家助产机构于2015年4月1日至9月30日出生的108 899例新生儿进行CH筛查，确诊CH患儿83例，其中男36例，女47例。根据确诊时甲状腺超声结果分为甲状腺发育异常组及SDH组，对SDH患儿进行干血斑DUOX2变异热点区域测序分析。将2011年至2012年经新生儿筛查确诊并进行DUOX2外显子及其相邻内含子变异分析的96例SDH患儿为对照[4]。CH诊断标准：新生儿筛查干血斑促甲状腺素(bsTSH)≥9 mU/L为阳性，召回复查满足下列3项中的2项即诊断为CH，并予左旋甲状腺素替代治疗：(1)血清促甲状腺素(sTSH)≥15 mU/L(出生3～30 d正常参考值为0.47～10.00 mU/L)；(2)游离甲状腺素(FT4)< 15 pmol/L(出生3～30 d正常参考值为12.00～29.34 pmol/L)；(3)甲状腺超声提示甲状腺模糊、发育不良、左右叶不对称等发育异常或甲状腺大[新生儿甲状腺体积正常参考值为(0.61±0.23) mL][5]。排除母孕期有甲状腺功能亢进病史或新生儿血清过氧化物酶抗体>200 U/L(正常参考值<60 U/L)者。本研究获得广州市妇女儿童医疗中心伦理委员会批准(批准文号：2014－073014)，患儿监护人均签署知情同意书。
采用时间荧光分辨法测定bsTSH水平，bsTSH≥9 mU/L为阳性，召回复查，符合CH诊断标准者予左旋甲状腺素治疗，2周复查甲状腺功能及血清甲状腺球蛋白，调整治疗，定期随访。2～3岁停左旋甲状腺素4周，复查sTSH、FT4、甲状腺超声，根据sTSH及FT4水平，将CH转归分为2类：(1)暂时性CH：TSH、FT4均正常；(2)永久性CH：又分为典型(sTSH≥15 mU/L)和轻型(sTSH 7～<15 mU/L)。
采用厦门致善生物科技有限公司Lab－Aid核酸分离试剂盒提取干血斑基因组DNA，根据文献[4]对DUOX2第5、6、8、9、14、17、19、20、25、27、28共11个外显子及相邻内含子(共7对引物)进行PCR产物直接测序分析。
采用SPSS 19.0软件进行数据分析。计量资料采用
±s表示，计数资料采用百分数(%)表示。采用Mann－Whitney U检验进行两个独立样本的非参数检验，采用χ2检验进行2个总体率或构成比的比较，P<0.05为差异有统计学意义。
确诊CH 83例，CH患病率为1∶1 312，其中SDH 61例，占73.5%。与2011年至2012年CH筛查结果比较，CH患病率增高(1∶1 312比1∶2 779)，差异有统计学意义(χ2＝32.000，P<0.001)，SDH所占比例(73.5%比76.6%)差异无统计学意义(χ2＝0.286，P＝0.593)。
61例SDH患者中，52例(85.2%)进行了干血斑DUOX2热点区域变异分析，其中27例(男12例，女15例)共检出33个DUOX2基因变异位点，包括双等位基因变异6例，单等位基因变异21例，51.9%(27/52例)的SDH患儿检出热点区域变异。共检出10种变异，其中9种为已知致病性变异，1种新变异即p.S1091F，新变异经氨基酸保守性分析提示突变氨基酸在10种不同物种中高度保守，经SIFT与PolyPhen－2软件预测均提示致病性变异可能性大。无义突变p.K530X最常见，占已检出突变位点的51.5%(17/33位点)，涉及16例(30.8%)SDH患儿；其次为p．E879K，涉及4例患儿；检出本课题组前期报道的5种新变异IV28＋1G>T、c.647－656del10ins15、c.3516－3531del16、c.2104－2106delGGA、477delC(表1)。与2011年至2012年DUOX2检测结果比较，SDH患儿DUOX2基因热点区域变异检出率(51.9%比59.4%)差异无统计学意义(χ2＝0.763，P＝0.382)。
疑似甲状腺素合成障碍性甲状腺功能减低症患儿27例临床特点及DUOX2基因热点区域测序结果
Clinical characteristics and DUOX2 variant hotspots of 27 children with suspected thyroid dyshormonogenesis
疑似甲状腺素合成障碍性甲状腺功能减低症患儿27例临床特点及DUOX2基因热点区域测序结果
Clinical characteristics and DUOX2 variant hotspots of 27 children with suspected thyroid dyshormonogenesis
| 编号 | 性别 | bsTSH(mU/L) | 诊断日龄(d) | sTSH(mU/L) | FT4(pmol/L) | TG(μg/L) | 甲状腺超声 | DUOX2热点突变结果 |
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 1a | 男 | 64.8 | 23 | >150.0 | 3.6 | 991.0 | 大 | p.K530X/p.K530X |
| 2 | 女 | 12.5 | 25 | 24.8 | 13.6 | 16.0 | 正常 | p.K530X/p.E879K |
| 3 | 男 | 18.8 | 45 | 21.5 | 11.9 | 249.1 | 正常 | p.K530X/IV28＋1G>T |
| 4 | 女 | 80.7 | 16 | >150.0 | 4.1 | 245.0 | 大 | p.K530X/IV28＋1G>T |
| 5 | 男 | 12.4 | 26 | 18.9 | 11.9 | 30.5 | 大 | p.K530X/c.647－656del10ins15 |
| 6 | 女 | 146.0 | 13 | >150.0 | 2.6 | >1 000.0 | 正常 | p.R885Q/p.R1110Q |
| 7 | 女 | 26.4 | 15 | 56.1 | 15.1 | 371.9 | 大 | p.K530X |
| 8 | 男 | 18.8 | 22 | 60.9 | 10.1 | 856.2 | 正常 | p.K530X |
| 9 | 女 | 11.8 | 21 | 57.6 | 9.9 | 11.9 | 正常 | p.K530X |
| 10 | 女 | 31.6 | 14 | 71.1 | 8.9 | 88.4 | 大 | p.K530X |
| 11 | 男 | 16.5 | 17 | 28.8 | 11.4 | / | 大 | p.K530X |
| 12a | 男 | 42.0 | 16 | >150.0 | 4.8 | >1 000.0 | 正常 | p.K530X |
| 13 | 女 | 18.2 | 30 | 10.1 | 13.2 | 397.0 | 大 | p.K530X |
| 14 | 男 | 41.5 | 18 | >150.0 | 5.7 | 906.6 | 大 | p.K530X |
| 15 | 男 | 12.0 | 30 | 15.5 | 13.6 | 87.5 | 大 | p.K530X |
| 16 | 男 | 28.0 | 14 | 108.4 | 7.5 | 9.2 | 正常 | p.K530X |
| 17 | 女 | 12.9 | 30 | 18.4 | 10.0 | 412.4 | 大 | p.K530X |
| 18a | 女 | 11.8 | 27 | >150.0 | 8.2 | 38.0 | 大 | p.E879K |
| 19 | 男 | 15.8 | 30 | 14.8 | 13.2 | / | 稍大 | p.E879K |
| 20 | 女 | 10.6 | 21 | 51.7 | 11.4 | 53.4 | 正常 | p.E879K |
| 21 | 女 | 16.3 | 22 | 53.2 | 11.3 | 896.4 | 正常 | p.R885Q |
| 22 | 女 | 37.3 | 11 | >150.0 | 7.2 | 87.5 | 大 | p.R1110Q |
| 23 | 女 | 59.5 | 32 | >150.0 | 5.8 | 41.4 | 大 | c.3516－3531del16 |
| 24 | 女 | 16.1 | 30 | 17.8 | 14.7 | 563.0 | 大 | c.647－656del10ins15 |
| 25 | 女 | 80.4 | 11 | 139.1 | 7.9 | >1 000.0 | 大 | c.2104－2106delGGA |
| 26 | 男 | 15.7 | 23 | 22.1 | 16.0 | / | 大 | c.477delC |
| 27 | 男 | 9.5 | 34 | 11.9 | 13.7 | 33.8 | 大 | p.S1091Fb |
注：bsTSH：干血斑促甲状腺素；sTSH：血清促甲状腺素；FT4：游离甲状腺素；TG：甲状腺球蛋白；a永久性CH；b新变异；/：未检测 bsTSH：dry blood spot thyrotropin；sTSH：serum thyrotropin；FT4：free thyroxine；TG：thyroglobulin；apermanent congenital hypothyroidism；bnew variation; /：not detected
3种已知多态性位点p.H678R、p.L1067S、p.L138P可能与CH发病有关，在52例SDH患儿中，p.H678R、p.L1067S、p.L138P检出率分别为35.6%(37/104位点)、35.6%(37/104)及37.5%(39/104)，与2011年至2012年SDH患儿检测结果(分别为32.3%、36.5%及40.1%)基本一致，差异均无统计学意义(χ2＝0.327，P＝0.567；χ2＝0.023，P＝0.880；χ2＝0.192，P＝0.661)；而与健康对照人群[4](分别为2.3%、2.3%及10.0%)比较，差异均有统计学意义(χ2＝45.125，P＝0.000；χ2＝45.125，P＝0.000；χ2＝21.125，P＝0.000)。
在检出DUOX2基因变异的27例患儿中，甲状腺大18例，左旋甲状腺素治疗起始量25 μg/d，维持量12.5～25.0 μg/d。2～3岁再评估甲状腺功能提示，24例(88.9%)为暂时性CH，3例(例1、例12、例18)为永久性CH。例1患儿为p.K530X纯合变异，停药后sTSH>150 mU/L，FT4 3.6 pmol/L，甲状腺大，继续左旋甲状腺素37.5 μg/d替代治疗。例12及例18表现为停药后sTSH轻度增高(8.6～13.0 mU/L)，FT4正常或轻度降低，左旋甲状腺素25 μg/d维持治疗。25例未见DUOX2热点变异的SDH患儿中，20例为暂时性CH(80.0%)，5例永久性CH，左旋甲状腺素维持量25.0～37.5 μg/d。DUOX2变异组与DUOX2无变异组bsTSH、sTSH、FT4、甲状腺球蛋白水平及暂时性CH比例比较，差异均无统计学意义(均P>0.05)。
随着新生儿筛查的普及，我国每年新增CH患儿近万例，但CH的病因及其临床转归尚不十分清楚。本课题组对2011年至2012年CH患儿回顾性研究显示，76.6%的CH患儿为SDH，DUOX2基因变异在SDH患儿中检出率高达62.5%，并存在热点变异区域[4]。本研究再次从人群流行病学角度，前瞻性地观察广州市新生儿CH的患病率、病因分类、疾病转归及DUOX2热点区域变异检出情况，结果显示广州市新生儿CH患病率呈明显上升趋势，其中甲状腺发育正常或甲状腺大的SDH占73.5%，且51.9%的SDH患儿可检出DUOX2热点区域致病性或高度疑似致病性变异，进一步证实DUOX2基因变异是本地区CH患病的重要遗传基础。
DUOX2定位于染色体15q15.3，长约22 kb，含34个外显子。DUOX2是一种跨膜蛋白，在双氧化酶成熟因子2(DUOXA2)协助下，DUOX2蛋白转移、成熟并定位于甲状腺滤泡细胞顶膜上。DUOX2是甲状腺产生过氧化氢的关键酶，当DUOX2/DUOXA2系统中任何成员异常均会影响过氧化氢的合成，进而影响甲状腺过氧化物酶(TPO)碘有机化过程，导致甲状腺素合成障碍。DUOX2基因呈常染色体隐性遗传，理论上DUOX2出现纯合或复合杂合变异才致病，但体外研究证实，DUOX2单等位基因变异也可导致过氧化氢生成减少，影响甲状腺素合成，从而引起暂时性或永久性CH[4,6,7,8,9,10]。本课题组前期研究及本研究均显示，经新生儿筛查诊断的CH患儿中，DUOX2杂合变异较纯合或复合杂合变异更多见。但本研究中，DUOX2杂合变异者尚不排除存在热点区域之外的致病性变异可能。
DUOX2变异存在种族、地域差异[9,11]。致病变异p.K530X是我国，尤其是南方地区，如广西、广州最常见变异，本研究中p.K530X变异占已检出变异位点的51.5%，占待检SDH患儿的30.8%，与本课题组前期研究及广西CH流行病学研究结果基本一致[4,8]。此外，本研究检测到前期报道的5种新变异IV28＋1G>T、c.647－656del10ins15、c.3516－3531del16、c.2104－2106 delGGA和477delC，进一步支持这5种变异为致病性变异[4]。新变异p.S1091F经突变氨基酸保守型分析及蛋白质结果和功能预测提示致病性变异可能大。
此外，日本学者认为p.H678R为功能性多态位点，该变异可导致DUOX2蛋白产生过氧化氢的能力损失40%[12]。本研究再次证实，在广州地区新生儿筛查确诊的CH患儿中，p.H678R、p.L1067S、p.L138P这3种多态性位点检出率均>30%，均显著高于健康对照人群的检出率(2.3%～10.0%)。p.H678R等功能性变异是否增加CH的易感性仍有待进一步研究。
本研究结果显示，DUOX2缺陷型SCH患儿临床表型与未见DUOX2缺陷的SDH患儿无显著差异，与本课题组前期研究结果一致[4]。其临床表型特征包括新生儿筛查时bsTSH轻－中度增高，确诊时sTSH明显增高，伴FT4降低或正常，甲状腺球蛋白增高、甲状腺大，左旋甲状腺素初始剂量较低(25 μg)，多数患儿2～3岁时甲状腺功能恢复正常。但值得注意的是，极少数患儿在停药后半年甚至更长时间内再次出现无症状性高TSH血症(轻度永久性CH)，其原因可能与基因变异及临床异质性有关，也可能与碘营养不足等因素有关，建议加强对CH筛查阳性高危儿的召回和停药后随访观察。
广州地区新生儿CH患病率增高原因尚不十分清楚，可能与遗传及环境因素有关。本研究结果显示，2015年新生儿期DUOX2缺陷所致CH检出率约为1∶3 403，较2011年至2012年的1∶5 804显著增高[4]，提示新生儿CH总体患病率增高与DUOX2缺陷所致CH检出增多有关。其原因如下：(1)新生儿筛查仪器及检测方法更新，bsTSH检测的敏感性及稳定性改善，bsTSH阳性切值附近的轻型患者检出增多。2014年10月本筛查中心启用干血斑全自动打孔仪及全自动荧光分析仪，bsTSH测定由过去全人工操作的免疫分析法改为全自动免疫荧光时间分辨法，减少人为误差。(2)人群碘摄入相对降低。2012年3月全国范围内调整食盐碘浓度，由35 mg/kg降至25 mg/kg，人群碘摄入量较前降低。但孕妇、2岁内婴儿是碘缺乏高危人群[13]，可能存在孕妇碘营养不足，从而导致携带DUOX2变异的新生儿出现CH生化改变。2016年本课题组观察了295例孕中期孕妇随机尿尿碘水平，提示40%的孕妇有碘不足(尿碘<150 μg/L)[14]。(3)遗传易感性。p.H678R等功能性多态位点携带率较高可能增加CH人群易感性，当机体对甲状腺素需求增加(如新生儿、孕期)或碘营养不足状态下可能出现不同程度的甲状腺激素合成不足。
综上，广州市CH患病率呈上升趋势，以SDH为主，51.9%的SDH患儿存在DUOX2热点变异，且多数为暂时性CH。本研究明确了新生儿筛查确诊的CH患儿DUOX2变异特点及其临床表型特征，为疾病健康教育、治疗随访及疾病转归预测等提供参考。
所有作者均声明不存在利益冲突
