6群肺炎链球菌是导致儿童社区感染的常见血清群之一，既往采用荚膜肿胀实验将6群分为6A和6B 2个亚型。随着基因测序分型方法的应用，近年来又发现了6C、6D、6E、6F和6H等新的亚型。肺炎链球菌结合疫苗(PCV)7应用后的国家或地区监测到6C型呈增长的趋势，应引起重视。现就6群肺炎链球菌新亚型的荚膜多糖合成基因、荚膜多糖结构、耐药性及分子流行病学进行阐述。
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肺炎链球菌是儿童社区获得性感染的主要病原菌，可引起细菌性脑膜炎、脓毒症、脓胸等侵袭性肺炎链球菌病(invasive pneumococcal disease，IPD)，据世界卫生组织统计，全球每年约有160万人死于肺炎链球菌引起的相关疾病，其中100万人为小于5岁的儿童[1]。根据肺炎链球菌荚膜多糖的不同，采用荚膜肿胀实验(que-llung reaction)将肺炎链球菌分为46个血清群、90多种血清型，其中6群是导致儿童IPD的常见血清群，在2007年前又被分为6A和6B型[2]，肺炎链球菌结合疫苗(pneumococcal conjugated vaccine，PCV)应用前，美国4.6%和10.6%的儿童IPD分别由6A和6B导致[3]，我国9.4%的儿童IPD由6B所导致[4]。近年来随着基因分型方法的应用，6群新亚型不断被发现，如6C、6D、6E、6F、6G和6H。现就6群肺炎链球菌新亚型的鉴定方法、荚膜多糖结构、基因序列和分子流行病学进行阐述，以加深对6群肺炎链球菌的认识。
6群肺炎链球菌荚膜多糖合成基因的长度为17.0～19.1 kb，包括荚膜多糖合成调控基因(wzg、wzh、wzd和wze)、糖基转移酶基因(wchA、wciN、wciO和wciP)、多糖重复单位聚合酶基因(wzy)、翻转酶基因(wzx)和修饰酶基因(rmlA、rm1C、rmlB和rmlD)。目前wciN包含wciNα和wciNβ 2种序列，分别编码荚膜多糖重复单位中的半乳糖和葡萄糖；wciP包含wciPα和wciPβ 2种序列，分别编码鼠李糖－(1→3)－核糖和鼠李糖－(1→4)－核糖重复单位，上述基因序列的不同组合可产生不同亚型。
2007年Park等[5]利用2种单克隆抗体从原来鉴定为6A的菌株中发现了1种新型，与Hyp6AG1和Hyp6AM3同时呈阳性反应的菌株仍命名为6A型，只与Hyp6AG1呈阳性反应的菌株命名为6C型。基因测序发现，6A型包含wciPα和wciNα基因，6C型包含wciPα和wciNβ基因，荚膜多糖重复单位分别为半乳糖－(1→3)－葡萄糖－(1→3)－鼠李糖－(1→3)－核糖和葡萄糖－(1→3)－葡萄糖－(1→3)－鼠李糖－(1→3)－核糖。2009年Jin等[6]采用基因分型方法从原来鉴定为6B的菌株中发现一种新型，将含有wciNα和wciPβ的菌株仍命名为6B，将含有wciNβ和wciPβ的菌株命名为6D，荚膜多糖重复单位分别为半乳糖－(1→3)－葡萄糖－(1→3)－鼠李糖－(1→4)－核糖和葡萄糖－(1→3)－葡萄糖－(1→3)－鼠李糖－(1→4)－核糖。2010年刘尊杰等[7]采用血清学方法对国内分离的6A、6B、6C和6D进行验证，并发现了1种新的因子抗血清6 d(表1)。
6群肺炎链球菌各亚型的分型方法
Typing methods for each type of serogroup 6Streptococcus pneumoniae
6群肺炎链球菌各亚型的分型方法
Typing methods for each type of serogroup 6Streptococcus pneumoniae
| 分型 | 6B | 6C | 6D | 6E | 6F | 6G | 6H | ||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 血清分型 | |||||||||
| 6b | ＋ | － | － | － | N | N | N | N | |
| 6c | － | ＋ | － | ＋ | N | N | N | N | |
| 6d | － | － | ＋ | ＋ | N | N | N | N | |
| 基因分型 | |||||||||
| wciNα | ＋ | ＋ | － | － | ＋ | wciNα存在1个碱基点突变 | wciNα存在2个碱基点突变 | ＋ | |
| wciNβ | － | － | ＋ | ＋ | － | － | － | － | |
| wciPα | ＋ | － | ＋ | － | － | － | ＋ | 在wciP位点存在1个点突变 | |
| wciPβ | － | ＋ | － | ＋ | ＋ | ＋ | － | ||
| wze | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | 第200－222位3个氨基酸缺失 | ＋ | ＋ | ＋ | |
注：＋：阳性；－：阴性；N：不明确 ＋：positive；－：negative；N：unknown
2013年Ko等[8]发现6B中有一类菌株在wze基因第220－222位点上存在3个氨基酸缺失，在wzy基因第220位点上为苏氨酸，不同于6A的丝氨酸和6B的丙氨酸，且该类菌株在流行病学和耐药性上不同于6D和其他6B型，命名为6E。6E型菌株的荚膜合成基因位点有较大变异，目前尚未分析6E型荚膜多糖的具体结构。
2015年Oliver等[9]对单克隆抗体分型方法无法区分出6A和6C、6B和6D的两类菌株采用气液色谱法进行荚膜多糖检测，发现其中一类菌株具有6A和6C的重复序列，将其命名为6F；另一类菌株具有6B和6D的重复序列，将其命名为6G。基因测序发现，6F型菌株的wciNα488位存在点突变(G→A)，导致第150位氨基酸由丙氨酸变成苏氨酸；6G型菌株除了存在上述位点的突变外，在wciNα113位还有新的点突变(G→A)，导致第38位氨基酸由天冬氨酸变成了天冬酰胺。
目前全球范围内有10多个国家或地区报道了6C和6E型的流行情况，包括美国、斐济、丹麦、中国、韩国、日本、泰国、波兰、澳大利亚、法国和秘鲁等，6G、6F和6H型尚未见流行病学报道。6D型主要来自中国、泰国、韩国及美国等地的报道。韩国6C和6D型在6群中的比率较高，分别为4.1%～4.5%和10.4%～12.9%[11,12]。
基于多位点序列分型(multi－locus sequence typing，MLST)，Carvalho等[13]报道分离自美国的42株6C型菌株主要为ST1390(28.6%)、ST1379(19.0%)和ST1292(16.7%)。Zhuo等[14]报道分离自澳大利亚的52株6C型主要为ST4227(26.9%)和ST1715(30.8%)。van der Linden等[15]从德国IPD儿童中分离出15株6C型，其中9(60.0%)株为ST1692。Satzke等[16]报道分离自斐济儿童的52株6C型主要为ST4240(94.2%)。Janoir等[17]报道分离自法国的101株6C型中46.5%(47株)属于ST386，该型属于多重耐药流行克隆Poland6B-20。Rolo等[18]报道，导致西班牙IPD的6C型菌株2/3与ST224有关。Porat等[19]报道，分离自以色列南部的6C型菌株中55.5%(27/49株)属于ST1692，分离自贝都因儿童鼻咽部的6C型菌株中88.1%(37/42株)属于ST3531。6C型对青霉素的不敏感率也存在地区差异，据文献报道最高的为西班牙(77.0%)，其次为中国(55.9%)、美国(46.7%)和葡萄牙(30.2%)[20]。上述研究提示，6C型在全球多个地区存在不同克隆和耐药率的流行。PCV7应用后，随着6C型菌株的增多，其基因多态性也在增加，在3年时间里，马萨诸塞州儿童鼻咽部定植的6C型的克隆从2个增加至7个[21]。
关于6D型的研究较少，仅见少数报道。Satzke等[16]报道，分离自斐济的24株6D型分为ST639(14株)、ST473(9株)和ST4240(1株)3个型。Choi等[11]报道，韩国存在多重耐药6D型菌株的克隆流行，14株6D型中有10株属于CC81克隆簇(包括7株ST189和3株ST282)，最低抑菌浓度(minimum inhibition concentration，MIC)为1～2 mg/L，均对青霉素不敏感，其余4株为ST3171，均对青霉素敏感。
Baek等[12]报道，分离自韩国的24株6E型对阿莫西林克拉维酸钾的不敏感率为8.3%，高于其他亚型，其中21株(87.5%)属于CC90克隆簇(即Spanin6B-2)。McEllistrem和Nahm[20]报道，分离自中国香港的7株6E型均为ST90。Andries等[22]报道，分离自英国的421株6E型中，203株(48.2%)属于CC90克隆簇，117株(27.8%)属于CC315克隆簇(即Poland6B-20)。Marimón等[23]报道，分离自西班牙的45株6E型的青霉素不敏感率为80.0%，明显高于6A、6B和6C的17.3%、66.0%和23.5%，其中20株(44.4%)为ST90。上述研究提示，6E型为6群中耐药性最高的一种亚型，主要集中在CC90和CC315克隆簇，在世界范围内克隆流行。
Yao等[24]和史伟等[25]报道，从1998年至2007年国内分离的210株6群中鉴定出10株(4.8%)6C和6株(2.9%)6D型，均对青霉素敏感，其中7株(70.0%)6C型为ST2912，5株(83.3%)6D型为ST982。陈琼等[26]从分离自1973年至1985年的25株6群中鉴定出3株6C和3株6D型。李马超等[27]从分离自2004年至2009年的33株6群菌株中鉴定出6株6C型，均对青霉素均敏感，脉冲凝胶电泳(Pulsed－field gel electrophoresis，PFGE)分型显示60%的菌株属于同一个克隆簇。Wei等[28]从分离自1997年至2016年的250株6群中鉴定出32株(12.8%)6C型，青霉素不敏感率为25%，其中20株(62.5%)为ST2912。上述研究提示，国内分离的6C型菌株主要为ST2912克隆，对青霉素相对敏感，不同于其他国家或地区的报道。
PCV应用后，美国1999年至2007年由6C型导致的儿童IPD的发生率从0.22/10万上升至0.58/10万，6C型在6群中的比率从7.5%上升至62.1%，青霉素不敏感率从11.4%上升至31.2%[13,29]。澳大利亚在2000年至2005年和2006年至2008年这2个时间段，由6C型导致的IPD的比例从3.3%上升至17.0%[14]。Nahm等[30]报道，PCV7使用后6C型菌株的构成比从0.6%上升至8.7%。Andries等[22]统计1972年至2014年来自超过15个国家或地区的974株6群肺炎链球菌数据发现，6C、6D和6E最早可追溯至1972年，PCV7使用前6A、6B、6C、6D和6E所占的比例分别为29.9%、9.6%、9.1%、0.5%和49.9%，PCV7使用后分别为43.4%、17.1%、22.4%、0和17.1%，6D和6E型明显下降，6A和6C型升高。上述研究提示PCV使用后存在"血清型替换"现象，PCV7对6A和6C型缺乏交叉免疫。PCV13在PCV7的基础上增加了6A型，由于6C和6A具有部分相似的荚膜成分，推测PCV13对6群各亚型具有免疫保护作用。
Yun等[31]报道，相同ST型可以包含不同亚型，如ST855包含6A和6C型，ST3168包含6B和6C型，ST282包含6A、6C和6D型；对荚膜基因序列进行比较发现，6A和6B、6C和6D之间的遗传距离较小，6A和6D具有高度相似的wzy和wzx序列，6C与部分6A的wzy序列几乎完全一致。Bratcher等[32]报道，6D型荚膜多糖的操纵子高度保守，基因变异较少，且与6A、6B和6C具有遗传关系，如芬兰和韩国的6D菌株同源性为99%，6D型和6C型基因座的同源性为98.6%。提示肺炎链球菌亚型的多样性可能是由于复杂的序列突变和基因重组导致的。
综上所述，目前肺炎链球菌共发现8个亚型，6A、6B、6C和6D已被血清学分型方法所证实，并明确了荚膜多糖的结构。6C和6D型在不同地区存在不同ST克隆的散发流行。6E型主要为CC90和CC315高耐药克隆簇，在世界范围内存在克隆流行。PCV7应用后应密切关注"血清型替换"现象。
所有作者均声明不存在利益冲突
