结核病(TB)是严重威胁儿童健康的重要疾病，世界卫生组织报道，2018年全球新发TB患者1 000万，死亡人数高达124万，其中儿童TB新发人数约为112万，死亡数约为17.3万。"发现、治疗所有病例以终止TB"的行动指出，有效的疫苗接种是对传染病最有效的控制措施。儿童TB由于临床症状不典型，早期诊断困难，导致治疗延误，因此早期疫苗接种对于预防儿童TB显得更为重要。然而目前全球广泛使用的唯一TB疫苗——卡介苗存在免疫持续时间有限、保护作用不明确、可引发卡介苗病等问题，新型疫苗的研发势在必行。现就TB疫苗研究进展及存在的挑战进行阐述，为加强疫苗研发，并解决现有问题提供指导。
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结核病(tuberculosis，TB)是危害全球儿童健康的重要传染病。据2019年世界卫生组织(World Health Organization，WHO)估算，2018年全球约有1 000万人罹患TB，124万人因该病死亡，其中儿童TB新发人数约为112万，死亡数约为17.3万[1]。与成人相比，儿童免疫功能发育尚不完善，自身抵御TB的能力较弱，同时儿童TB病原学诊断困难、临床症状不典型、药物敏感性试验阳性率低，更易延误治疗[2]。因此，儿童TB负担严峻，早期进行疫苗接种对于儿童TB的预防显得更为重要。迄今为止，卡介苗(Bacillus Calmette－Guerin，BCG)是全球唯一许可的用于预防TB的疫苗[3,4]，该疫苗自1921年研发至今，每年约有1亿多儿童接种，占全球每年出生儿童数的89%[5]。接种BCG对重症TB，如粟粒型TB和结核性脑膜炎等具有较好的保护作用。尽管目前BCG的接种率很高，但依然存在诸多不足，如对于青少年和成年人的免疫保护作用不明确[3]，保护作用持续时间有限[6]，不同免疫方式保护作用差异较大等问题[7,8,9]，特别是对于一些存在免疫缺陷的新生儿，早期BCG接种可引起卡介苗病，严重者可导致患儿死亡，其危害不容忽视[10]。
WHO与全球基金和遏制TB伙伴关系发起了"发现、治疗所有病例以终止TB"的行动，同时，WHO 2016年提出的终止TB策略中，也专门针对儿童TB防控提出明确目标。要实现这一目标，有效的疫苗接种是最有效、最长期的控制措施，目前鉴于BCG存在很多局限性，新型疫苗研发势在必行。有研究预测，如果成功研发获得一种针对青少年和成年人的疫苗，其保护率可达到60%、保护时间能长达10年，便可在2024年至2050年预防1 700万例TB的发生[11]。这提示，新型TB疫苗的研发对于有效控制全球TB的流行具有重要意义。
合理的疫苗设计是疫苗研发的基础，获得理想的疫苗，需要关注以下3个方面：(1)抗原成分的选择：合理的抗原成分是新型疫苗设计的关键。(2)明确疫苗所诱发的免疫类型：随着基因工程的发展，DNA疫苗及佐剂的研发，可同时诱导体液免疫和细胞免疫的疫苗是最佳的疫苗策略。(3)免疫途径的选择：免疫途径可决定疫苗诱导的免疫类型和持续时间，是疫苗研发需要关注的另一个重要因素。目前新型疫苗研发，均综合了以上3个因素，从动物实验评估，最终进入临床试验[12]。现就儿童TB疫苗研发，特别是已进入临床试验阶段的疫苗相关研究进行综述，并提出目前存在的问题，以了解TB疫苗研发现状，为其研发提供线索及参考。
TB疫苗的发展目前正处于分水岭时期，大量学者致力于新型疫苗的研发，尽管已有很多新型疫苗问世，但多数处于早期研发阶段，部分已经过动物实验评估，进入临床试验阶段，临床使用价值仍需进一步评估。常见的疫苗种类根据研发策略不同分为4类：减毒活疫苗、灭活疫苗、DNA疫苗及亚单位疫苗。
减毒活疫苗的原理主要是通过定点删除或诱变细菌中的一些毒性基因，使其毒性失去或减弱，但其仍可显著表达多种抗原并激活机体T淋巴细胞，产生较强免疫效力。BCG属于减毒活疫苗。目前处于研发阶段的减毒活疫苗主要作为预防性疫苗使用，一方面希望保证安全性的同时，进一步提高免疫原性，最终达到取代BCG用于新生儿接种目的；另一方面也希望可用于结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis，MTB)暴露后青少年和成人接种，产生较好的免疫保护作用，以弥补BCG对于青少年和成人保护作用较差这一不足。
目前正在进行临床试验的减毒活疫苗包括VPM1002和MTBVAC。VPM1002通过敲除MTB的某些毒性基因而获得基因缺失突变株，可同时表达多种抗原并激活免疫反应。动物研究及临床试验初步证明，VPM1002疫苗不但可替代BCG预防重症TB的发生，还可预防青少年和成人结核潜伏感染(latent tuberculosis infection，LTBI)及活动性结核病(active tuberculosis，ATB)的复发。目前，VPM1002疫苗已经在印度人群中开展Ⅲ期临床试验，以评估其在预防成人ATB复发中的有效性，结果显示，与安慰剂组比较，VPM1002免疫组患者12个月内ATB复发率下降了50%[4]，提示该疫苗是预防ATB复发的有效疫苗。MTBVAC是另外一种已进入临床试验阶段的减毒活疫苗，该疫苗保留了大部分可激发T淋巴细胞反应的表位，包括BCG中已去除的早期分泌靶抗原6(early secreted antigen target 6，ESAT－6)和培养滤液蛋白(10－kDa culture filtrate protein，CFP10)，具有更好的免疫潜力。2001年以来，大量临床试验显示，MTBVAC具有与BCG一样的安全性，同时可诱导产生更好的免疫原性[13,14]。目前MTBVAC已在南非地区开展了Ⅰ期临床试验，以评估其在人群中的安全性、局部耐受性和免疫原性，结果显示，MTBVAC的安全性、耐受性及免疫原性与BCG类似，且与BCG相比，MTBVAC可诱导机体产生更高水平的CD4＋中央记忆性T淋巴细胞。此外，MTBVAC是目前进入新生儿预防性疫苗临床阶段的唯一疫苗，其可诱导婴幼儿产生持久的CD4细胞免疫应答反应，在婴幼儿中具有替代BCG进行早期接种的潜力[5,15,16]。
灭活疫苗是指通过加热或使用化学试剂将细菌灭活后形成的疫苗，可由整个细菌组分或其裂解片段组成。相较于减毒活疫苗，灭活疫苗发生感染的风险较小，免疫原性较低；由于该疫苗在体内不复制，因此需要通过提高免疫剂量及反复接种来维持较好的免疫保护作用。
Vaccae™和RUTI均为进入临床试验阶段的灭活疫苗。Vaccae™是一种治疗性疫苗，研究显示，接种该疫苗并接受抗结核治疗的耐多药TB患者，6个月后的痰液阴转率为43%，远高于仅接受药物治疗者(21%)[17]。目前该疫苗已在我国开展Ⅲ期临床试验，以评估其在预防LTBI患者转化为ATB中的有效性[18]。RUTI是由西班牙学者研制获得的治疗性灭活疫苗，主要通过去除灭活MTB的毒素组分并将其包裹在脂质体内研制而成，RUTI已在南非进入Ⅱa期临床试验，可用于ATB的治疗[19]。RUTI的早期Ⅰ期临床试验显示，其对于ATB具有较好免疫原性和安全性；随后Ⅱ期临床试验发现，RUTI对于人类免疫缺陷病毒(HIV)阴性和HIV阳性的LTBI志愿者同样具有较好的免疫原性和安全性。目前正在南非开展Ⅱa期临床试验，以进一步评价其在治疗耐多药ATB中的免疫原性和安全性[19]。
DNA疫苗亦称基因疫苗，通过将MTB具有免疫保护性的特异抗原编码基因与表达载体连接而成。DNA疫苗免疫后，具有免疫原性的蛋白可以持续表达，诱导机体产生持久的保护性免疫，同时DNA疫苗可以激活细胞毒性特异性T淋巴细胞，利用细胞毒性T淋巴细胞的识别和杀伤功能，对巨噬细胞内的MTB发挥清除作用。
DNA疫苗研发主要的候选基因包括休眠存活调节子(dormancy survival regulator，DosR)编码基因、热休克蛋白65(heat shock protein 65，HSP65)编码基因、结核分枝杆菌主要蛋白抗原64(major protein antigens of Mycobacterium tuberculosis 64，MPT64)编码基因及基因组差异区1(region of difference，RD1)的ESAT6和CFP10编码基因等[20,21,22]。根据插入特异抗原的数量不同，DNA疫苗分为单价和多价联合DNA疫苗。将多种特异抗原编码基因同时插入质粒载体，构建能同时表达多种相应抗原的联合多价DNA疫苗，以进一步提高保护效力。以RD1区Rv3875和Rv3874编码的ESAT6和CFP10为例，这2个蛋白为RD1区核心抗原。ESAT6和CFP10可使感染MTB的小鼠体内的记忆效应T淋巴细胞增殖，促使其在感染早期产生高水平的γ干扰素。此外，分泌蛋白抗原85B(secretory protein antigen 85B，Ag85B)和ESAT6联合其他基因片段构建的DNA疫苗可增强BCG的免疫保护作用，并产生较好的免疫原性[23]。虽然动物实验证明DNA多价疫苗安全性较好，但由于外源DNA存在整合到宿主基因的风险，进而导致抑癌基因失活或致癌基因活化，因此DNA疫苗的临床使用价值一直存在争议。
亚单位疫苗研究始于20世纪80年代，其原理是将MTB生长过程中分泌的具有免疫保护作用的蛋白或多肽分离纯化，联合佐剂制成疫苗。亚单位疫苗的候选抗原以ESAT6、CFP10、MPT32、MPT64、HSP65等为主[24,25,26]。多数学者认同多种蛋白联合效果优于单一蛋白，Ag85B和ESAT6蛋白是当前研究的热点抗原。H1为Ag85B－ESAT6融合蛋白，目前美国已进入Ⅲa期临床试验，Ag85B和ESAT6都具有较高的免疫原性，可诱导产生较好的免疫保护作用，H1疫苗在这2种抗原的基础上加入了新型Toll样受体9(toll－like receptor，TLR9)激动辅助剂IC31，可更好地对TB患者、接种过BCG疫苗的健康人群及进行过抗TB治疗的患者产生保护作用，并保证其安全性[27]。H4－IC31为Ag85B－TB10.4融合蛋白，并加入了IC31。研究发现，候选疫苗H4－IC31可诱导接种过BCG的婴儿及青少年产生细胞免疫应答，进而发挥免疫保护作用，目前该疫苗已进入法国Ⅱa期临床试验[27,28]。H56是由MTB多阶段抗原融合蛋白组成的亚单位疫苗，包含早期分泌蛋白Ag85B、ESAT－6和LTBI相关蛋白Rv2660c，相当于H1＋ Rv2660c融合蛋白，目前进入丹麦Ⅱa期临床试验[29]。
在过去20年中，TB疫苗研发取得了重大进展。目前已有多种候选疫苗在临床试验中进行评估。然而，成功开发一种普遍有效的TB疫苗仍面临重大挑战。
选择合适的具有免疫原性的抗原表位是疫苗研发的重点和难点。目前TB疫苗的抗原表位的筛选处于瓶颈期，如何选择免疫原性最好的抗原表位？是否需要多个抗原表位的联合？哪种抗原能获得更好的免疫原性？是目前抗原表位选择的主要问题。选择合适的抗原表位，应从MTB的致病机制出发，在明确最佳免疫反应效果的基础上，挑选合适的抗原表位来构建疫苗，可有效降低疫苗研发失败的比例。多种抗原表位联合及评估，也是提高疫苗免疫原性的重要策略。近年来，随着生物信息学的飞速发展，利用高科技进行抗原表位筛选成为未来发展的一个重要方向[30]。
目前，小鼠和豚鼠是用于评估候选疫苗的小动物物种，评估小动物物种感染MTB后体内的细菌载量和存活率，是评价疫苗保护效果的第一步。但研究者发现，利用动物模型很难完全模拟临床感染状态[31]。如，通常情况下通过气雾剂或气管内直接装置将MTB输送到肺部进行感染建立动物模型，而临床感染常由反复低剂量暴露引起。另外，在动物模型上，很难模拟人类感染的复杂性，如混合感染、地理位置差异、营养缺乏等。很多在人体中出现的症状，在动物模型中很难模拟，如结核肉芽肿。而大动物模型如猿长类动物模型，虽然与人类症状类似，但成本较高，动物伦理严格，这也在一定程度上限制了这类模型的使用。未来疫苗研发中，随着候选疫苗的临床前数据不断积累及分析，选择合适的动物模型，对于疫苗的评价非常重要。
疫苗进入临床试验阶段后，如何确定规范的终点评估标准是疫苗评价面临的另一个重要问题，缺乏明确的标准来定义终点事件，疫苗评价标准会存在差异。以评估LTBI的标准来说，γ－干扰素释放试验(interferon－gamma release assays，IGRAs)和结核菌素试验(tuberculin skin test，TST)是评估LTBI的2个常用方法，IGRAs特异性优于TST，不受BCG接种及非结核分枝杆菌(nontuberculous mycobacterial，NTM)感染的影响。但IGRAs检测的是一种效应T淋巴细胞反应，在免疫功能低下的人群中可能呈假阴性[32]，可见选择哪种方法用于LTBI评估，将直接影响疫苗的保护评估价值。提示，明确的终点评估标准是困扰疫苗临床试验的重要问题。
TB疫苗开发面临的另一挑战是克服人群多样性[33,34]。不同于动物实验，人群存在更明显的异质性。相较于青壮年人群，新生儿和儿童免疫系统发育不完善，老年人免疫功能减退，疫苗所诱发的免疫保护作用均不同。因此想获得针对所有人群有保护作用的疫苗存在难度。另一方面，NTM早期暴露会影响疫苗的免疫保护效果。不同地理位置的人群，早期NTM的暴露情况不同，同一种疫苗诱导的免疫保护作用不同。因此，获得针对不同地区均有保护作用的疫苗也存在难度。此外，基因异质性会影响疫苗保护效果。以B淋巴细胞为例，不同个体的B淋巴细胞在成熟过程中，编码抗体抗原识别区的序列会随机重组。疫苗作为外来抗原刺激B淋巴细胞发生克隆增殖的反应不同，因此诱导的免疫保护作用也不同。针对人群的年龄异质性、地理位置异质性及基因异质性获取具有均衡免疫保护效果的疫苗，是目前研发面临的主要问题。
我国作为TB高负担国家，TB流行的趋势严峻。儿童作为特殊群体，免疫功能发育尚不完善，诊断和治疗更为困难，疫苗接种显得尤为重要。BCG作为现有疫苗，存在多种不足，新型疫苗研发是弥补这一不足的主要方式。然而目前疫苗研发依然存在很多难以解决的问题。解决现有研发存在的问题、促进新型疫苗发展、提高疫苗保护率和安全性是未来疫苗研发的重中之重。
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