感染性疾病是全球儿童致残和死亡的主要原因之一，早期快速精准诊断感染致病原并进行针对性治疗对患儿预后至关重要。分子生物学技术，特别是核酸检测技术的更新和进步极大推动了病原生物学精准检测的发展。核酸分子杂交技术、核酸扩增技术、基因芯片、测序技术、基于基因编辑的病原检测技术等不仅拓展了病原核酸检测的通量，还显著提高了检测灵敏性，已逐渐成为儿童感染性疾病诊断的重要检测手段。现对不同核酸分子检测技术方法、检测时间、检测效能及潜在卫生经济学效益等多方面进行评估，以期明确不同儿童感染性疾病病原检测的适宜策略，为临床医师的遴选提供参考。
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感染性疾病由细菌、病毒、真菌等多种病原体引起，起病急，临床表现缺乏特异性，发病率和致死率较高，一直威胁着人类健康。据统计，全球每年约有1 500万人死于感染[1]。在儿童这一特殊群体中，病毒是引起感染的主要元凶。全球每年约有3 310万儿童感染呼吸道合胞病毒(RSV)，约10万人死于流感引起的呼吸系统相关疾病[2,3]。此外，在造血干细胞移植或器官移植后，由于长期免疫抑制治疗、放化疗等，此类患者多处于免疫功能低下或抑制状态，更是各类病原体易感人群。值得注意的是，由于抗生素的不合理使用甚至滥用，耐药菌株，如耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)、多重耐药结核菌(MDR-TB)的不断增多使得临床治疗较为棘手[4,5]。感染性疾病除了给患者身体造成巨大伤害，也给其家庭及社会带来较为严重的经济负担。在美国，平均每年病毒性脑炎的总花费为350万～540万美元，感染性腹泻病造成的经济损失约为1.5亿美元[6,7]。
目前病原学检测常用的方法有培养、免疫学检测和核酸分子检测等。培养一直是病原检测的金标准，并可提供药敏结果，但存在周期长、敏感性低和检测病原体种类有限等不足。免疫学检测较快速，但敏感性较低。当前用于病原检测的分子诊断方法包括多重PCR、基因芯片及二代测序等多种技术，其原理是基于核酸的诊断技术，通过对微生物的DNA或RNA的检测实现对疾病的诊断，较传统检测方法具有高敏感性、特异性，快速，不易受抗生素影响等显著优势。
及时、有效的感染病原学检测不仅可实现精准诊治、降低感染性疾病的病死率、减少耐药性的发生，且在减轻家庭、社会经济负担方面具有潜在价值。基于此，现对不同分子检测技术在感染性疾病的应用及潜在的卫生经济学效益进行阐述。
PCR又称体外DNA扩增技术，1985年由美国Cetus公司的Kary Mullis首创，用于扩增位于两段已知引物序列之间的DNA片段，通过温度变化控制DNA的变性和复性，加入特异性引物、DNA聚合酶及dNTP完成不同病原特定基因的体外扩增，具有较好的敏感性和特异性。广州医科大学第一附属医院的一项研究显示，在154例社区获得性肺炎患者中，与培养法相比，PCR对MRSA的检出敏感性为100.0%，特异性为89.6%，阳性预测值(PPV)为75.0%，阴性预测值(NPV)为100.0%，且24 h内可获得检测结果，实现了MRSA的早期诊断，第一时间为临床诊治提供病原学依据[8]。
然而，PCR操作复杂，对操作环境要求高，室内质量控制严格；且在病毒感染早期因其载量较低，通过单次PCR扩增可能无法检出所有病毒，存在漏诊的可能[9]。
RT-PCR通过提取微生物的RNA，以其中的mRNA作为模板，通过反转录合成cDNA，再以cDNA为模板进行PCR扩增。且在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR过程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析，具有定量、定性等特点。2012年至2013年南非开普敦红十字会战争纪念儿童医院进行的一项单中心回顾性研究发现，RT-PCR具有较高的敏感性和特异性(分别为100.0%和97.2%)，且与培养结果的一致性较好(97.3%)。在292例临床疑似中枢感染的患者中，RT-PCR检出细菌12例(8例肺炎链球菌、3例脑膜炎奈瑟菌和1例流感嗜血杆菌)，而脑脊液培养仅4例阳性(3例肺炎链球菌和1例流感嗜血杆菌)，且耗时短[10]。
RT-PCR因具有不同发射光谱不能重叠的检测原理，使其检测的病原体种类有限，无法进行广谱病原体的检测[11]。
IAT是继PCR后发展的一种新型体外核酸扩增技术，包括切口酶核酸恒温扩增技术(nicking enzyme mediated amplification，NEMA)、环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)等。其与普通PCR相比的优点主要在于检测过程中不需要进行耗时长且复杂的热循环，在同一温度下进行核酸扩增，检测速度快。
Alere I测试盒是采用基于切口内切酶扩增反应(NEAR)对微生物的核酸进行检测。Schnee等[12]运用Alere I RSV检测试剂盒检测518例呼吸道标本，其对RSV检出的敏感性和特异性分别为93%和96%，且在13 min内即可获得检测结果。LAMP技术在难以培养的单核细胞增多李斯特菌检测中不仅具有较高的敏感性(96.7%)，且45 min即可获得检测结果[13]。
IAT技术在同一温度下进行核酸扩增，只适合检测特定的标本，如呼吸道或咽部拭子，检测具有局限性。
多重分子检测又称多重引物PCR，是在同一个PCR反应体系中加入多对引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR反应，可同时用于多种微生物检测或鉴定。具有通量高、样本消耗量少、覆盖病原体种类广、可检测混合性感染及提高病毒检出率等特点。
2019年上海儿童医学中心的一项研究显示，在68例回顾性研究中，多重分子检测的总体特异性为92.1%，在无乳链球菌和新生隐球菌的敏感性为100.0%[14]，且1 h即可获得检测结果，克服了培养法周期长、低检出率及低特异性的缺陷。Antalis等[15]在332例呼吸道标本中使用多重分子检测检出68例混合感染，流感病毒/RSV为最常见的混合感染(66.2%)。Thongprachum等[16]在751例粪便标本中检出124例(16.5%)双重病毒感染，17例(2.3%)为3种病毒的混合感染，且23 min内获得检测结果，弥补了传统PCR、RT-PCR单一病原体检测的不足。西班牙加泰罗尼亚地区研究发现[17]，在儿童脑干脑炎暴发期间，快速多重分子检测在阴性样本中共检测出4例肠道病毒(EV)阳性和3例单纯疱疹病毒6型(HSV-6)阳性，其中4例EV经基因型检测均证实为EV-A71病毒[17]。快速多重分子检测所具备的高敏感性相对于常规RT-PCR方法，能够更有效地检出低病毒载量的样本。但多重分子检测价格昂贵、仅能检测多重引物覆盖的有限病原体种类，且不能提供药敏及微生物定量结果。
基因芯片技术是将数以百计或千计的寡核苷酸探针结合到芯片载体上，利用高特异性的核酸杂交反应，通过分析PCR产物杂交结果对病原体的核酸序列进行检测，具有通量高、高度平行、微型化等特点。
2014年苏州大学附属医院的一项研究显示，与Lowenstein-Jensen培养(金标准)对比，在42例结核病患者中通过DNA芯片技术对利福平和异烟肼耐药性菌株的检测敏感性分别为92.8%、66.7%，特异性分别为93.8%和81.0%；且1 h左右可获得结核杆菌的药敏结果[5]。刘毓刚等[18]研究发现，使用水痘-带状疱疹病毒基因芯片技术对病原体的检出率为86%，且能特异地检出病毒各分型。但基因芯片技术敏感性较低、检测的病原体种类有限。
NGS又称高通量测序，是基于PCR和基因芯片发展而来的DNA测序技术，其开创性地引入了可逆终止末端，从而实现边合成边测序，在DNA复制过程中通过捕捉新添加的碱基所携带的特殊标记来确定DNA序列。现有的NGS包括瑞士Roche公司的454平台、美国ABI公司的SOLiD平台、美国Illumina公司的HiSeq平台以及国内华大基因公司的BGI平台。该检测能一次并行对几十万、几百万条DNA分子进行测序，具有较高的通量，使得对1个物种的基因组进行全面分析成为可能，在罕见、未知的病原体检测中具有显著优势。
Langelier等[19]研究发现，在急性下呼吸道感染患者中，NGS检出6例常规PCR试剂盒未覆盖的罕见病毒株，如轮状病毒A型、人冠状病毒229E，展现了其在临床罕见病原体检测中的突出优势。澳大利亚一项研究显示，3例行器官移植的患者在移植后4～6周内均患感染，因传统的病原学检测方法覆盖的病原体种类有限，3例患者的病原学培养、血清学和PCR检测均阴性，而NGS却检出1种新的病原体——沙粒病毒[20]。Saeb等[21]也有类似报道，1例18岁急性淋巴细胞白血病患者移植后出现不明原因发热，最终通过NGS检测(血液标本)，确诊为苛养菌溶血棒状杆菌感染。上述报道提示，NGS技术在新发病原体检测中具有较高的临床使用价值。
然而，NGS因获得单条序列长度很短，想要得到准确的基因序列信息依赖于稳定的建库方法、较高的测序覆盖度和准确的序列拼接技术，并且在大量的背景病原体报告中寻找真正的致病病原体对临床医师而言仍是不小的挑战。
三代测序技术又称从头测序技术，有美国PacBio公司的Single Molecule Real-Time(SMRT)技术和英国Oxford Nanopore Technologies(ONT)公司的纳米孔单分子技术。与NGS相比，三代测序技术的优势在于测序过程中不需要经过PCR扩增，对每条DNA分子进行单独测序，避免了PCR扩增过程中出现的碱基配对错误、偏好性和人为引入的突变，使得对新的、复杂基因组的分辨和分析成为可能；其次，该技术读长较长，可获得准确的基因序列信息，弥补了NGS读长短的不足。
国外的一项研究通过SMRT技术在246株多重耐药鲍曼不动杆菌菌株中测序出一种新的、复杂基因组IOMTU433，且该基因组中包含了碳青霉烯酶基因(OXA、NDM-1)[22]。此外，Bergfors等[23]在慢性丙型肝炎病毒(HCV)感染患者中，运用SMRT检测出一基因序列NS5A，该基因序列编码的蛋白易使HCV对抗病毒药物耐药，使感染慢性化。这些发现不仅可以更好地掌握耐药病原体的耐药机制，而且能够指导临床早期合理用药，并为靶点治疗的新型药物的开发提供依据。病毒的基因变异性较大，有研究利用ONT对流感病毒A的全基因组进行测序，发现了新的突变基因PB2和NS，表明利用这项技术可发现新出现的流感毒株，有助于新疫苗的制备[24]。但三代测序技术测序错误率高，局限了其在临床广泛推广。
基因编辑技术是一种新型的可以对基因组进行定点修饰的技术，借助特异性DNA双链断裂激活细胞天然的修复机制，可以准确地定位到基因组的每一位点，在此位点上剪短靶标DNA片段并插入新的基因片段。成簇的规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)系统是目前较多使用的一种基因编辑系统，Cas12、Cas13和Cas14三种酶已广泛应用于病毒的检测。
在美国加州大学进行的一项研究发现[25]，一种基于CRISPR-Cas12的DETECTR检测可以快速检出新型冠状病毒。在19例新冠患者和42例非新冠的呼吸道感染患者中，与RT-PCR检测相比，DETECTR检测的阳性预测符合率为95%，阴性预测符合率为100%，而且快速，约45 min即可获得检测结果，对快速爆发的新冠疫情管理提供了较为重要的信息。
2019年张文宏团队研发了一款针对结核分枝杆菌的CRISPR-结核分枝杆菌(CRISPR-MTB)检测技术，开拓了基因编辑技术在结核分枝杆菌检测中的新领域。在116例确诊结核分枝杆菌感染患者中，与培养和半巢式全自动实时荧光定量PCR检测(GeneXpertMTB/RIF)比较，CRISPR-MTB检测具有较高的敏感性(GeneXpertMTB/RIF：79%比66%，P＝0.004；培养：79%比33%，P<0.001)，且一致性较好(100%、97%)，其特异性为98%。此外，该检测只需0.5 mL样本量，检测周期为1.5 h，可实现结核分枝杆菌的快速诊断[26]。
基因编辑技术是一项新技术，操作复杂、价格昂贵，局限了其在临床的广泛使用，但其在感染性疾病的病原体检测中具有较好的应用前景。
分子检测不仅可实现感染性疾病病原体的及时、有效诊断，还可有效减少抗生素的使用、调整抗病毒药物、降低住院天数和节省治疗费用，有较好的经济学效益。
Radmard等[27]报道416例疑诊中枢感染患者在病因学明确诊断前均已行抗生素治疗，抗生素暴露的中位时间为2 h。而通过分子检测仅有68例仍需继续使用抗生素治疗。德国慕尼黑医路德维希马克西米利安大学豪纳儿童医院的一项单中心回顾性研究发现，使用快速分子检测的疑似脑膜脑炎患儿不仅抗生素治疗时间显著减少(3.0 d比4.0 d，P＝0.28)，且阿昔洛韦的使用时间也从3.0 d降低至1.0 d(P<0.001)，且这种差异在新生儿中较为显著[28]。2016年至2019年在美国洛杉矶儿童医院开展的一项研究显示，快速分子检测检出了25例人疱疹病毒6型(HHV-6)感染患儿，12例使用了阿昔洛韦的患儿或调整为更昔洛韦治疗，或采用针对HHV-6的特殊治疗[29]。
分子检测具有快速、通量高、覆盖的病原体广、可检测罕见、未知的病原体等显著优势，且具有较好的经济学效益。鉴于不同分子检测技术的特点，多重分子检测在中枢感染的病毒感染中发挥重要作用，可提高病毒的检出率；而在下呼吸道感染的病毒检测中，IAT检测快，在流感、RSV暴发季节更适用于门急诊使用。在临床高度怀疑感染而常规病原学检测阴性时可首选通量相对较高的多重分子检测，NGS也可作为进一步的筛查手段。常见病原菌感染时，倘若出现抗感染效果欠佳甚至病情恶化时，结合当地的医疗水平及个人的经济状况，可考虑使用多重分子检测排除混合感染或通过三代测序技术排查治疗过程中病原菌出现新的突变基因序列可能，或将多重分子检测与NGS联合使用，排除混合感染中合并罕见、新发病原体的感染。
所有作者均声明不存在利益冲突
