人腺病毒是儿童呼吸系统病毒性疾病的常见病原之一。腺病毒感染多见于婴儿和5岁以下儿童，可呈流行性、地方性或散发性。引起腺病毒肺炎的主要血清型包括1、2、3、4、5、7、8、19、21和35型，更严重的肺炎与3、7、14、21和55型有关。重症腺病毒肺炎可危及生命，部分患儿肺部可遗留永久性损伤，如闭塞性细支气管炎等，进而影响患儿的生存质量。因此，早期诊断和合理有效治疗对于改善患儿预后至关重要。现主要就儿童腺病毒肺炎的病原诊断和抗病毒治疗方面进行讨论。
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人腺病毒(human adenovirus，HAdV)属于腺病毒科(family adenoviridae)哺乳动物腺病毒属(genus mastadenovirus)，为线状DNA病毒，其血清型分为A～G共7个亚组，已发现的HAdV血清型超过70个，多数可引起人类呼吸道、胃肠道、泌尿道及眼等部位感染[1]。HAdV感染多见于婴儿和5岁以下儿童，可呈流行性、地方性或散发性。据估计，在儿童呼吸道病毒感染性疾病中，腺病毒占2%～35%，包括上呼吸道感染(5%～17%)、支气管炎(5%～11%)、毛细支气管炎(2%～16%)和肺炎(4%～11%)等[1]。引起腺病毒肺炎的主要血清型包括1、2、3、4、5、7、8、19、21和35型，更严重的肺炎与3、7、14、21和55型有关[1]，其主要病理改变为灶状或融合性坏死性肺炎和支气管炎。一项儿童社区获得性肺炎腺病毒感染的多中心研究结果显示，在2014年11月至2016年11月我国北方和南方12家医院临床诊断为社区获得性肺炎的2 723例住院患儿的鼻咽抽吸物或咽拭子中检出HAdV阳性标本156例(5.7%)；成功分型了80例HAdV阳性标本，其中3型32例，7型9例，1型12例，2型15例，5型10例，6型和4型各1例；北方地区优势流行型别为HAdV-3型(30.8%，8/26例)和HAdV-7型(26.9%，7/26例)，而南方地区的优势流行型别为HAdV-3型(44.4%，24/54例)和HAdV-2型(22.2%，12/54例)[2]，该研究主要反映了HAdV在我国非流行期间引起肺炎的主要优势血清型和地理分布特点以及在社区获得性肺炎中所占比重。1958年冬季，我国华北和东北地区曾发生HAdV肺炎大规模流行，病原学研究显示以HAdV-3型和7型为主，约占90%，重症肺炎病死率高达33.6%[3]。2018年底至2019年上半年，我国中部和南部地区再次出现HAdV流行[4]，同期，儿童重症HAdV肺炎明显增多，以同济医院为例，其儿科重症监护病房(PICU)共收治75例重症HAdV肺炎患者，危重型病例占60%(45例)，采用宏基因组二代测序(mNGS)检测病原显示95.5%(63/68例)为HAdV-7型，可见HAdV肺炎严重危害儿童健康。现主要就儿童HAdV肺炎的病原诊断和抗病毒治疗方面进行阐述。
主要包括病毒分离、特异性腺病毒抗原和核酸检测及特异性抗体检查。
大多数HAdV可利用原代人胚肾细胞培养进行分离，其方法可靠，阳性率高，利用标准血清可鉴定血清型，被认为是传统的诊断HAdV感染的"金标准"，但需时7～14 d。采用小瓶或塑料孔板培养和样本离心法可更快检出培养物中的HAdV，一般用于回顾性诊断。
采用放射免疫法、免疫荧光法(IFA)或酶联免疫吸附试验(ELISA)等方法检测呼吸道样本中特异性HAdV抗原，如六邻体蛋白或纤维蛋白，已广泛应用于临床。与病毒分离相比较，其特异性高，可达95%以上，但敏感性相对较低[1]。其优势在于可在数小时内完成检测，适用于快速诊断。Rocholl等[5]采用直接荧光法(DFA)检测儿童鼻洗液样本中HAdV抗原，与病毒分离相比较，特异性达100.0%，敏感性为62.5%。在2019年HAdV流行期间，同济医院采用IFA检测咽拭子HAdV抗原，检出率仅为20.8%(15/72例)，因本组重症HAdV肺炎患儿中有95.5%经mNGS检测证实为HAdV-7型感染，故不除外所用检测试剂对于HAdV-7型检测敏感性较低的可能性。
已有数种PCR技术用于检测HAdV感染，并迅速成为有用的快速诊断手段，其特异性和敏感性均高，可与病毒分离相媲美，作为快速诊断HAdV的"金标准"，尤其是可在甲醛固定和石蜡包埋组织或其他活检和尸检标本中检测HAdV DNA来进行组织病原学诊断[1]。常用方法：(1)实时定量PCR。有学者发现，用PCR法可在77.7% DFA检测阴性的样本中检出病毒DNA[6]，表明PCR检测HAdV核酸的敏感性明显高于HAdV抗原检查。Lion等[7]开发了一个具有种特异性的实时定量PCR系统，可定量检测51种HAdV血清型，可在异体骨髓移植受者发生播散性HAdV病出现临床症状前(中位数为3周)的外周血中检出病毒DNA，可见检测病毒DNA载量尤其有助于免疫缺陷患者播散性HAdV感染的早期诊断与处理。(2)多重PCR。一般有2种模式：一是检测HAdV的多种血清型，如Buckwalter等[8]开发了一种PCR系统可定性检测57种HAdV血清型，用于各种临床样本的检测具有高敏感性和特异性；二是同时检测多种病毒或病原体，这种模式在临床应用中更为普遍。需要注意的是，有些检测呼吸道病毒的多重PCR系统，如生物膜阵列呼吸组合(Film Array Respiratory Panel)对于某些HAdV血清型的敏感度较低，因此当临床高度怀疑HAdV感染时，建议使用替代方法检测阴性标本中的HAdV[1]。(3)巢式PCR。Aberle等[9]建立巢式PCR系统，收集出现症状后第1周内的急性期血清，可在72%初次感染的免疫正常儿童和25%再发感染(recurrent infection)的患儿血清中检出HAdV DNA。(4)重组酶介导核酸扩增技术(recombinase aided amplification，RAA)。其可检测HAdV或同时检测HAdV-3和HAdV-7病毒DNA[10]。
腺病毒特异性抗体是腺病毒感染的间接指标，其结果判断可遵循传统的血清学诊断标准。血清腺病毒特异性IgM抗体提示急性腺病毒感染，但阳性率不高；急性期和恢复期双份血清显示特异性IgG抗体滴度≥4倍增高可回顾性诊断近期感染。型特异性抗体检测可通过中和试验、ELISA或血凝抑制试验来确定。
mNGS的优势在于能广泛覆盖病原体；可检测跨物种来源的微生物；可通过深度测序验证来鉴定新发或未知病原体，并可直接鉴定病原体的种类至型或亚型级别；临床上特别有助于急难重症且常规病原学检查阴性患者的病原学诊断，虽然目前还存在一些需要改进的问题，如人源基因组背景的消减、胞内菌的破壁技术、检测耐药基因和毒力因子方法的优化、易降解的RNA病毒的检测及优化和扩大数据库以提高比对准确度等，且价格昂贵，但其在检测未知的或常规检测方法难以发现的病原体方面的优势毋庸置疑，对于疑难和危重型感染性疾病的快速病原学诊断具有重要意义和临床应用价值，往往成为正确抉择治疗方案的基础和契机，有助于赢得救治机会和改善患者预后。2019年末武汉市发现不明原因肺炎，最初就是通过mNGS确定其病原为新型冠状病毒。同济医院PICU在2019年初也是通过该技术获知当时流行的重症肺炎的病原为HAdV-7型。
对于呼吸道感染而言，呼吸道样本包括上呼吸道样本(如鼻咽拭子和咽拭子或鼻咽吸取物或洗液等)和下呼吸道样本(如深咳出的痰液、气管吸出物及支气管肺泡灌洗液等)是最常用于检测病原标志物(如抗原和核酸)的标本。然而，对于呼吸道样本阳性结果的解读一直具有挑战性，尤其是采用高敏感技术(如PCR法)。已有研究显示，PCR法检测健康无症状儿童的腺病毒阳性率为11%，而病毒分离率仅为0.6%。Kalu等[11]在一项76例儿童581例次上呼吸道感染的队列研究中发现，采用PCR法可在同一宿主的鼻咽洗液中检出相同血清型腺病毒，持续时间可超过200 d。呼吸道病毒混合感染(coinfection)也使得对阳性结果的解读更具挑战性，有研究表明，55%～63%的患者存在腺病毒在内的混合感染[12]。此外，对来自呼吸道标本的F组腺病毒(40型和41型)的PCR阳性结果的临床意义还不能清楚解读。支气管肺泡灌洗液在取样过程中，易混入上呼吸道分泌物，因此采用高敏感核酸检测获得阳性结果并不一定能够代表定位于下呼吸道的病原。上述事实提示，对于PCR阳性结果，必需予以合理的临床解读。一般来说，临床解读的基本原则和要点是结合患者临床进行综合分析，包括临床上是否存在病毒性肺炎，其影像学和实验室检查改变是否符合腺病毒肺炎特点，病毒性肺炎与病原检出在时间上是否一致等。有学者提出，在使用PCR检测腺病毒时最好同时进行定量病毒载量与鉴定血清型，可帮助评估PCR阳性结果的临床意义[12]。
病毒血症在儿童普通型呼吸道腺病毒感染中较为常见[9]。曾从下呼吸道感染婴儿的外周血单个核细胞中分离到HAdV-2，证实病毒血症的存在[13]。同济医院PICU的资料显示，mNGS检测血样本的阳性率高达91.7%，与mNGS检测支气管肺泡灌洗液的结果有很好的一致性，提示重症腺病毒肺炎患者存在持续病毒血症，故在疾病进展期选择血样本有很好的诊断价值，相对于支气管肺泡灌洗液取样而言，其安全性明显更高。相较于呼吸道标本，血样本属于无菌标本，被污染的机会极少，阳性结果通常具有临床意义。
合并脑炎患者可在脑脊液中检出腺病毒核酸。同济医院PICU也在1例血mNGS腺病毒阳性患儿的尿中检出同种血清型腺病毒核酸序列。与血样本一样，脑脊液样本也属于无菌标本，阳性结果具有临床意义。而尿标本通常不被选用于腺病毒核酸检测，一般在腺病毒感染的病毒血症期或泌尿系统受累时可获阳性结果[14]。
对于mNGS结果的解读，同样应遵循"结合临床"的基本原则和要点。一方面要注意仪器污染所形成的假阳性结果(特点为几乎所有检测样本都存在高序列数同种微生物)，另一方面，有些序列数很少的"痕迹"微生物也不要轻易放过，尤其是破菌技术不足的分枝杆菌和真菌等，还应结合临床进行综合分析，必要时可采取诊断性治疗加以判断。同样，对于支气管肺泡灌洗液样本，也存在可混入上呼吸道分泌物的问题，应合理解读其阳性结果。
迄今，尚缺乏安全、特效的抗腺病毒药物。虽然利巴韦林(Ribavirin，RBV)和西多福韦(Cidofovir，CDV)在体外有良好的抗腺病毒活性，但临床治疗的成功经验有限，应在谨慎权衡获益与药物不良反应之后再考虑是否使用。
Mynarek等[15]报道了238例儿科异体造血干细胞移植(HSCT)受者9年内的前瞻性血清腺病毒PCR监测数据，发现血清腺病毒载量峰值>104拷贝/mL是生存不良的独立危险因素，建议对血清腺病毒载量>104拷贝/mL或至少2个样本>103拷贝/mL，以及病毒载量增加的HSCT患者进行抢先抗病毒治疗。
RBV是鸟苷类似物，为一种强单磷酸次黄嘌呤核苷酸脱氢酶抑制剂，可阻碍病毒核酸合成，具有广谱抗病毒性能[16]，对多种病毒，如呼吸道合胞病毒(RSV)、流感病毒(甲型和乙型)、腺病毒、丙型肝炎病毒、单纯疱疹病毒(HSV)、麻疹病毒和汉坦病毒等有抑制作用。临床上主要用于治疗慢性丙型肝炎(口服，需与干扰素等联合应用)、RSV所致肺炎或支气管炎(静脉用药或雾化吸入)、腺病毒肺炎(静脉用药)、肾病综合征出血热早期(静脉用药)和眼部或皮肤HSV感染(滴眼或局部涂敷)。已有多项采用静脉内注射RBV成功治疗免疫抑制患者播散性腺病毒感染的报道[1,17,18]。国外推荐疗法为：负荷量30 mg/(kg·d)，维持量15 mg/(kg·d)，分3次给药[18]。同济医院PICU采用上述疗法治疗61例严重腺病毒肺炎(重症26例和危重症35例)，发现重症组使用RBV治疗后发热超过3 d者比例仅为7.7%，显著低于危重症组的51.4%，提示在重症早期应用RBV可缩短热程，并降低危重症发生风险。RBV的主要不良反应为溶血性贫血。关于其治疗腺病毒肺炎的疗效和安全性数据仍有限，还需积累临床经验或更大样本的临床研究。
CDV是一种胞嘧啶核苷类似物，对多种DNA病毒，包括人巨细胞病毒(HCMV)、HSV、多瘤病毒和腺病毒等具有抗病毒效应。CDV的主要不良反应为肾毒性，同时给予静脉输液水化和口服丙磺舒治疗，可最大限度地减轻其肾毒性。Ljungman等[19]采用CDV治疗HSCT受者的HAdV感染，在前3周内每周1次和其后每2周1次用药，每次5 mg/kg，成功治愈69%的患者。其他学者减少CDV剂量(每次1 mg/kg，每周3次)也获得类似疗效[1]。Yusuf等[20]报道，58例儿科HSCT接受者接受CDV治疗后，有57例获得临床症状完全缓解。
BCV是一种新型的口服长效抗病毒药物，是CDV的脂质结合前体，可在细胞内降解而释放有效活性成分CDV。其在体外对双链DNA病毒具有广泛抑制活性，包括腺病毒、HCMV、HSV、水痘带状疱疹病毒、BK多瘤病毒、乳头瘤病毒、痘病毒和传染性软疣病毒等。与CDV相比，BCV对腺病毒的体外抑制活性更强，而肾毒性更低。在动物模型中能够显著降低腺病毒相关疾病的发病率和死亡率。2014年3月至2016年8月美国开展了一项多中心、开放标签的Ⅲ期临床试验，以评估BCV对HSCT受者腺病毒感染的疗效及安全性和耐受性，12岁以下受试者的剂量为2 mg/kg，每周2次，每周总剂量不超过200 mg，共12周，持续感染或复发高风险者可延长至24周，由于不良事件和死亡引发的治疗终止率较高而导致该Ⅲ期临床试验失败[21]。有关BCV治疗腺病毒感染的临床研究还有待进一步开展。
该疗效与T淋巴细胞数量无关，且腺病毒特异性T淋巴细胞可持续扩增，不受腺病毒血症的影响。Di Nardo等[22]报道1例10岁男童因患先天性无核细胞性血小板减少症接受去T淋巴细胞单倍体相合HSCT，发生严重腺病毒肺炎，需使用体外膜氧合(ECMO)治疗。在使用CDV治疗后发生出血性膀胱炎。采用腺病毒特异性T淋巴细胞过继转移治疗后，患儿在7 d内顺利脱离ECMO，10 d内脱离呼吸机。
早期有报道显示，1例免疫缺陷儿童患有严重弥散性HAdV-7a型肺炎，在接受大剂量高滴度HAdV-7a免疫血清球蛋白后病情获得显著改善[23]。
某些HAdV血清型，如3型和7型易引起重症肺炎，可危及儿童生命。现有的病毒学检查中，病毒核酸检测阳性率高，已研发的新技术如多重PCR系统等可直接确定血清型并同时检测多种腺病毒，已成为快速诊断HAdV感染的"金标准"。新技术mNGS的检出率最高，更适用于常规检查不能确诊或者不能确定血清型的重症或危重症患者。呼吸道分泌物是最常用样本，无论采用哪种检测方法，都需合理解读其诊断肺炎的临床意义，其基本要点是结合患者临床进行综合分析。鉴于腺病毒肺炎常存在病毒血症，尤其是重症病例，在疾病进展期选择血样本有很好的诊断价值。目前，尚缺乏特效的抗腺病毒药物，RBV和CDV有临床治疗成功的有限经验，应在权衡获益与药物不良反应之后谨慎使用，早期应用可缩短热程，并降低危重症发生风险。
作者声明不存在利益冲突
