慢性肾脏病(chronic kidney disease，CKD)是一个重大的世界性公共卫生问题，严重危害人类生命健康。据统计，每年每百万儿童中有5~10名儿童进展至终末期肾病(end stage kidney disease，ESKD)。随着CKD进展至ESKD，可发生进行性高磷血症、高钙血症及甲状旁腺激素(parathyroid hormone，PTH)、维生素D等矿物质代谢失调和生长激素(growth hormone，GH)水平异常^[1,2]。钙-磷-甲状旁腺激素-维生素D轴调节失调可导致CKD矿物质和骨代谢紊乱^[3]。矿物质和骨代谢失衡及生长激素绝对缺乏将影响CKD患儿的生长发育。心血管疾病是CKD患儿重要的死亡原因之一^[4]。CKD矿物质代谢失调和血管钙化作为心血管疾病发病率的独立预测因子，在很大程度上增加了该类患儿发生心血管疾病的风险^[4]。

抗衰老基因Klotho编码的Klotho蛋白在CKD中表达下降，主要作为骨源性成纤维细胞生长因子23 (fibroblast growth factor 23，FGF23)的辅因子，成纤维细胞生长因子受体(fibroblast growth factor receptor，FGFR)与Klotho是FGF23的共受体，一同构成Klotho-FGFR-FGF23轴，调节矿物质和骨代谢，并参与肾性骨营养不良的形成^[3]；与此同时，Klotho蛋白作为一种循环激素，具有内分泌作用，通过预防内皮功能障碍、血管钙化对心血管系统具有保护作用^[5]；此外，Klotho蛋白通过与GH-胰岛素样生长因子-1 (insulin like growth factor-1，IGF-1)轴相互作用共同调控体内钙磷平衡并介导GH的分泌^[6]。现就Klotho基因和蛋白的基本特性、Klotho蛋白的生物学功能及其在血管钙化、CKD矿物质骨病和CKD患儿生长发育中的作用进行综述。

Klotho家族成员包括α-、β-、γ-Klotho基因。β-和γ-Klotho是根据它们与α-Klotho的同源性发现的，它们共享一个单程跨膜蛋白^[7]。本综述仅关注α-Klotho，以下段落中的术语Klotho指的是α-Klotho。

Klotho基因是Kuro等^[7]日本学者在研究小鼠自发性高血压时发现的与衰老相关的基因。体外研究表明，Klotho基因敲除小鼠表现出类似早衰的多器官衰竭综合征，包括寿命缩短、矿物质代谢紊乱及多器官衰竭，如不孕症、骨质疏松、心肌病、动脉、皮肤萎缩、肺气肿^[3,4,7]。Klotho基因在脑脉络丛、垂体、骨骼、甲状腺、主动脉、结肠、卵巢、睾丸中均有表达，其中在肾脏中表达水平最高^[3,7]。

Klotho基因全长约50 kbp，由5个外显子组成，并编码一种单程跨膜蛋白(人和小鼠分别各有1 012和1 014个氨基酸)。该蛋白由一个较大的胞外结构域组成，包括980个N-末端残基，然后是一个21个氨基酸的跨膜结构域和一个11个残基的小结构域，对应细胞内的C-末端。膜结合型Klotho蛋白的胞外区由2个440个氨基酸的内部重复序列组成(称为KL1和KL2)，形成与β-葡萄糖苷酶家族1高度同源的胞外结构域，它们是通过全长转录本剪接产生的，可以被金属蛋白酶(a disintegrin and metalloprotease，ADAM)家族的成员ADAM10和ADAM17切割，并作为可溶性Klotho蛋白(裂解的Klotho)释放到循环中。此外，另一种选择性剪接的Klotho mRNA转录被假定为编码分泌型Klotho蛋白，相当于KL1结构域。在人类中，该转录过程可能经历了无意义介导的mRNA衰退，并未翻译成分泌型Klotho蛋白亚型^[8]。因此人类可能不存在分泌型Klotho蛋白。即使存在，其功能也应该不活跃，原因主要是KL1和KL2都不具有生物相关的糖苷酶活性，只有两者形成串联结构域才能发挥β-葡萄糖苷酶作用。该假定的蛋白尚未被鉴定，到目前为止还未在人体血清中检测到^[9]。可溶性Klotho是循环中的主要功能形式，存在于血液、尿液和脑脊液中^[10]，作为内分泌或旁分泌因子影响多个器官，如肾脏、骨、脑、心、肺和内皮，其水平随着年龄的增长而下降，儿童期Klotho水平高于老年期。此外，Klotho的另一种功能形式称为膜结合型Klotho，它主要参与FGFR的信号传递。

尿液中的可溶性Klotho并非是血清中的可溶性Klotho直接通过肾小球过滤来的。关于尿液中为何存在可溶性Klotho，有以下2种解释：可溶性Klotho会通过肾近端小管的细胞转运蛋白从基底外侧到达管腔侧，再从尿液中排出；表达于肾小管细胞顶膜上的膜型Klotho蛋白脱落直接进入尿液^[11]。CKD患者肾脏Klotho mRNA表达低下，并与肾小球滤过率呈正相关，其变化与血清和尿液Klotho的变化相似，因此血清和尿Klotho可以替代肾脏Klotho作为肾功能下降的敏感生物标志物^[12]。血清或尿液中可溶性Klotho的测定具有可行性却存在一定的困难。市面上已有用于检测循环中可溶性Klotho蛋白的酶联免疫吸附分析(ELISA)试剂盒，由于不同Klotho形式之间高度保守的序列，很难将全长可溶性Klotho与其他存在于体液中的短形式(KL1或KL2结构域)和分泌型Klotho区分开。此外，研究人员还建立了抗KL2抗体KM2119以及抗KL1大鼠单抗(KM2076和KM2365)的免疫沉淀-免疫印迹法检测血清和尿液中的可溶性Klotho蛋白。然而，使用目前商业试剂盒或可用的抗体来定量测量体液中的Klotho，只能测量循环中的总可溶性Klotho，很难将其(全长Klotho、KL1或KL2片段)鉴别开来^[13,14]。

膜结合型Klotho蛋白是配体成纤维细胞因子FGF与靶器官上的FGFR高亲和力结合所必需的辅助受体。FGF19、FGF21和FGF23被归类为FGF19亚家族，FGFR有4种：FGFR1~4，FGFs与FGFRs结合形成复合体通过磷酸化下游信号分子来传递信号，在能量和矿物质代谢的调节中起内分泌因子或激素的作用^[15]。FGF23是一种骨源性激素，主要由成骨细胞和骨细胞产生，其分泌受到磷酸盐、维生素D、甲状旁腺激素的刺激。膜结合型Klotho蛋白的主要功能是与FGFR1c、FGFR3c和FGFR4形成复合物，并将它们的标准型转化为FGF23的特异性受体。在近端肾小管，Klotho-FGFR复合物与血源性FGF23结合，不仅下调磷酸钠共转运蛋白NaPi-IIa的膜表达，直接抑制肾近端小管对尿磷酸盐的重吸收，同时，还下调1α-羟化酶的表达，抑制生物活性1，25-二羟基维生素D₃的合成，间接抑制肠道对磷酸盐的吸收^[16]。在肾远端小管，FGF23通过瞬时受体电位缬氨酸-5通道(transient receptor potential vallinoid 5 channel，TRPV5)刺激钙重吸收^[17]，调节钙稳态。维生素D负责肠道和肾脏对磷酸盐和钙的重吸收，Klotho基因敲除小鼠体内维生素D水平升高导致血浆钙和磷的水平均升高，并导致血管钙化。此外，膜结合型Klotho蛋白表达于甲状旁腺，介导FGF23抑制PTH的合成和分泌^[15]。Klotho和钙敏感受体是PTH合成的负调控因子，共同调节PTH的合成以维持体内钙平衡^[18]。PTH刺激肾脏对钙的重吸收，同时促进活性维生素D的合成，进而诱导肠道对钙的吸收。研究表明，骨形成细胞(成骨细胞和骨细胞)表达少量的Klotho^[5]，并通过FGFR-Klotho-FGF23复合物直接作用于骨细胞，导致骨形成和骨体积的增加^[19]。因此，Klotho-FGF23系统在CKD的矿物质和骨代谢改变中起至关重要的作用。

可溶性Klotho蛋白具有唾液酸酶活性，可独立于FGF23调节多种离子通道和转运体的活性，包括肾远端小管上皮细胞瞬时受体电位缬氨酸-5通道TRPV5和ATP敏感的内向整流钾通道1 (renal outer medullary potassium channel1，ROMK1)^[3,17]。TRPV5和ROMK1均属于糖蛋白，可溶性Klotho特异性地水解TRPV5和ROMK1糖链上的糖残基，通过糖残基与细胞外半乳糖凝集素1的相互作用，增加肾上皮细胞表面TRPV5和ROMK1的丰度，并导致肾脏对钙重吸收和钾分泌的增加。值得一提的是，可溶性Klotho蛋白还可以通过其β-葡萄糖醛酸酶活性^[3]修饰磷酸钠共转运体NaPi-IIa的多糖，抑制肾近端小管上皮细胞NaPi-IIa的活性，来增加尿磷酸盐的排泄，这也不依赖于FGF23。此外，循环中可溶性Klotho蛋白可通过激活甲状旁腺的钠-钾ATP酶并促进PTH的分泌^[20]。可溶性Klotho可介导FGF23直接作用于骨细胞，并通过丝裂原活化蛋白激酶/细胞外调节蛋白激酶1/2 (mitogenactivated protein kinase/ extracelluar regulated protein kinases，MAPK/ERK1/2)途径抑制成骨细胞矿化和成骨细胞标记基因的表达。可溶性Klotho还以FGFR1依赖的方式增强FGF23对小鼠成骨样细胞碱性磷酸酶的抑制作用^[16]。

可溶性Klotho蛋白不仅独立于FGF23介导离子稳态，还可通过GH-IGF-1轴调控钙磷和维生素D代谢及生长激素的分泌。GH刺激肝细胞合成和释放IGF-1，而IGF-1通过经典的负反馈机制抑制GHRH和GH的分泌^[21]。GH作用于人体几乎所有组织，包括骨、软骨、脂肪组织等，其中骨骼增长导致人体增高。大量研究证实，GH参与肾脏骨和矿物质代谢，并通过刺激IGF-1的分泌实现对骨的纵向生长、代谢及骨转化的调节；还能调控1α-羟化酶转录水平介导维生素D的合成，如维生素D缺乏性佝偻病常伴IGF-1水平下降，该疾病治疗过程中骨骺软骨细胞的增殖加速也通过GH-IGF-1轴发挥作用；并促进肾小管对尿磷酸盐和钙的重吸收^[6]。可溶性Klotho蛋白与GH-IGF-1轴密切相关、互相调控^[22]。GH-IGF-1轴上调Klotho蛋白表达，Klotho蛋白负反馈抑制外周IGF-1的分泌^[23]；此外，Klotho蛋白抑制IGF-1对垂体的负反馈作用间接促进GH的分泌。体外研究证实，Klotho蛋白可促进腺垂体细胞分泌生长激素，小鼠皮下注射Klotho蛋白也可增加肝脏IGF-1以及胰岛素样生长因子结合蛋白3 (insulin like growth factor binding protein 3，IGFBP3)的表达，升高血清GH水平^[23]。此外，可溶性Klotho蛋白作为碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)的辅助因子^[23]，通过活化细胞外调节蛋白激酶促进GH的分泌^[6]。

血管钙化在CKD病程的早期即出现，并随着肾脏功能的恶化而变得更加普遍，因此在CKD和终末期肾脏病(ESRD)患者中产生很高的心血管死亡和发病风险^[4]。研究表明，血管钙化是一个由细胞介导的高度调控过程，涉及多种诱导剂和抑制剂。CKD的血管钙化诱因很多，包括高钙血症、高磷血症、炎症细胞因子、一氧化氮等^[24,25]。CKD患者和动物模型中Klotho蛋白的表达水平均降低，研究发现，Klotho缺乏在体内加速了人动脉血管平滑肌细胞的钙化，并诱导CKD血管钙化，机制如下：一方面，Klotho蛋白作为抗炎调节剂，促进血清磷的负平衡，克服包括磷在内的多种因素诱导的血管内皮细胞和平滑肌细胞的衰老和凋亡；另一方面，Klotho蛋白调节一氧化氮的产生以维持内皮完整性，CKD血管钙化的病理生理基础之一是血管内膜和中层受一氧化氮、氧化应激、高血压等的破坏，Klotho通过调控血管内皮生长因子受体-2和调节钙内流的瞬时受体电位通道介导一氧化氮的生成，维持血管内皮的完整性和通透性^[24]。

在高磷存在的情况下，血管平滑肌细胞释放膜结合的基质小泡和凋亡小体，通过上调骨标记蛋白、骨形态发生蛋白和骨桥蛋白的表达，促进血管钙化的发生^[24]。Hum等^[26]发现，通过病毒载体稳定输送可溶性Klotho可降低Klotho缺陷小鼠的血磷水平，研究表明，Klotho对血管钙化的调节作用是通过降钙素/降钙素基因相关肽(intermedin1-53，IMD1-53)介导产生的，IMD1-53通过介导钙素受体/修饰蛋白复合物和蛋白激酶A信号的转导，上调Klotho蛋白的表达水平。进一步研究发现，IMD1-53对心血管系统起保护作用，以保护心脏免受缺血和高血压引起的心脏损伤，并防止血管钙化^[26]。据报道，通过给予环氧合酶2抑制剂等药物干预，可以在不显著降低血清磷水平的情况下改善Klotho缺陷小鼠的血管钙化^[24]。低磷饮食和活性维生素D制剂的应用可部分恢复Klotho缺陷小鼠Klotho的表达，有助于防止血管钙化的发生^[27]。最近对糖尿病肾衰竭小鼠模型的一项研究表明，给予Klotho可降低高磷血症并防止主动脉钙化。综合现有的研究结果表明，Klotho对血管系统起到保护作用，并防止或改善血管钙化的发展。

CKD-矿物性骨病(mineral bone disorder，MBD)是一种全身性疾病，其特征是血清生化异常，包括高磷血症、高钙血症、肾性骨病和血管钙化^[24]。CKD相关的血管钙化和心血管死亡部分归因于CKD-MBD。研究表明，介导肾脏损伤和修复的因子参与了CKD-MBD的发生^[28]，这些因子包括Wnt信号、Dickkopf1 (Dkk1)和硬化素及激活素A^[29]。其中，Wnt信号在诱导成骨细胞活性、骨骼发育和维持骨量方面发挥关键作用，硬化素和Dkk1是Wnt信号通路的内源性抑制剂，主要由骨细胞产生。CKD-MBD的致病因素包括高磷血症、维生素D缺乏、血管钙化、Klotho缺失、FGF23增多、肾性骨病、甲状旁腺功能亢进症^[28]。本综述中，主要关注与Klotho相关的几个方面。

如前所述，Klotho在CKD中的表达显著降低。既往研究表明，Klotho基因敲除小鼠表现出普遍的骨体积增加和骨转换低的骨骼表型。体外细胞培养发现，Klotho基因敲除小鼠成骨细胞前体细胞数量减少，来自该培养体系的成骨细胞显示出较低的碱性磷酸酶活性；进一步研究发现当骨髓细胞来源于Klotho基因敲除小鼠时，骨髓细胞和成骨细胞共培养时破骨细胞的生成减少^[14]。以上结果表明Klotho基因敲除小鼠骨转换低的部分原因是成骨细胞和破骨细胞功能受损，但并未阐明该骨骼表型是由于骨形成细胞中Klotho蛋白的功能缺陷还是与Klotho-FGF23系统相关的全身性矿物质代谢障碍所致^[14]。肾衰竭时骨细胞Klotho表达减少与肾性骨营养不良的发病机制有关。越来越多的证据表明，FGF23以自分泌/旁分泌的方式，通过诱导Dkk1及随后对Wnt途径的抑制，介导对骨细胞分化和矿化的直接作用。Carrillo-López等^[30]利用大鼠骨肉瘤细胞系检测了FGF23对Wnt通路的影响，证实在可溶性Klotho蛋白存在的情况下，FGF23直接通过MAPK通路诱导Dkk1，从而抑制Wnt信号转导。因此，CKD患者骨细胞特异性的Klotho缺失可能通过FGF23介导的Wnt途径活化，最终导致骨形成显著增加，从而减轻与肾性骨营养不良相关的骨丢失^[31]。最近，研究人员发现Klotho蛋白丢失是CKD-MBD小鼠肾脏和骨损伤的关键事件，在CKD-MBD小鼠模型中，组蛋白去乙酰化酶抑制内源性Klotho蛋白的恢复可减轻CKD相关的骨并发症^[32]。同样，大黄酸通过启动子超甲基化调节Klotho的表达，可保护CKD小鼠免受肾脏和骨骼损伤。当Klotho基因被敲除时，大黄酸在很大程度上便失去了肾脏的保护作用^[33]。以上研究结果提示Klotho缺乏症与CKD-MBD的发生密切相关，Klotho恢复有利于血管钙化和CKD-MBD的改善。

生长迟缓是尿毒症儿童最常见且严重的合并症之一，影响患儿成年期的最终身高。矿物质代谢紊乱、肾性骨病、贫血、代谢性酸中毒、尿素等毒素清除低下等因素均会导致尿毒症患儿的身高增长障碍。如前所述，Klotho蛋白通过介导FGF23、GH-IGF-1轴或激素样作用调节钙磷、甲状旁腺激素、维生素D等矿物质代谢。由于Klotho蛋白在CKD患儿中显著降低，因此容易导致高磷血症、血管钙化和肾性骨病等，这将在很大程度上延缓CKD患儿的身高增长。治疗CKD患儿生长迟缓应首先纠正矿物质代谢紊乱、肾性骨病、贫血、代谢性酸中毒等。正常的磷酸盐稳态对于正常的线性生长和生长板的适当矿化是必不可少的，生长板是负责线性生长的主要结构，其中Klotho对CKD患儿的线性生长发挥重要作用。CKD患儿中可溶性Klotho水平降低，补充外源性Klotho蛋白或激活内源性Klotho蛋白的产生可增加CKD患儿的尿磷酸盐排泄、调控矿物质和骨代谢。因此我们推测，Klotho蛋白可通过纠正CKD患儿的高磷血症、矿物质和骨代谢紊乱，改善该类患儿的生长迟缓。

GH缺乏是导致儿童生长迟缓的重要因素之一。尿毒症儿童的GH水平往往正常甚至轻度升高，可能与肾脏清除减少有关^[1]。尿毒症患儿对正常或者升高的GH水平反应低下提示机体对该剂量的GH水平存在抵抗。多项研究报道，超生理剂量的GH治疗能促进尿毒症儿童的身高追长，改善生长障碍^[34]。体外研究表明，Klotho基因缺陷小鼠明显瘦小、体内GH水平下降，腹腔注射Klotho蛋白后，血清中GH水平升高，生长迟缓改善^[6]。Rubinek等^[35]通过对29例GH缺乏症患儿进行长达3~11年的GH替代治疗，治疗期间观察到Klotho蛋白水平显著高于治疗前和健康对照组。以上研究结果提示，Klotho蛋白是一种潜在的GH剂量调节生物标志物。因此，推测Klotho蛋白能促进尿毒症患儿体内GH的分泌，并可能促进其身高增长。如前所述，改善尿毒症儿童生长迟缓需要超生理剂量的GH，优化GH剂量对于提高治疗效果、成本效益和安全性很重要；然而，对于补充外源性Klotho蛋白是否能促进尿毒症患儿体内GH的水平达到超生理剂量，以及需要补充多大剂量的外源性Klotho蛋白才足以达到治疗剂量的GH水平，目前尚未达成共识，亟待进一步研究证实。

Klotho蛋白通过以膜受体和类激素方式，并作用于复合物FGFR-FGF23及代谢轴GH-IGF-1，共同发挥抗衰老、调控钙磷等矿物质代谢、抗血管钙化、改善肾性骨病和生长障碍等作用。目前市场上已有ELISA和蛋白印迹等多种方法用于检测血清Klotho蛋白水平，因此临床检测Klotho蛋白完全可行。

综上所述，通过对Klotho蛋白生物学功能的研究，有助于了解慢性肾脏病患者血管钙化、肾性骨营养不良、生长迟缓的形成机制。鉴于Klotho蛋白具有肾脏、心血管、骨骼等系统的保护作用以及临床检测Klotho蛋白的可行性，Klotho蛋白在CKD治疗上存在着巨大的前景，有望成为治疗CKD患者血管钙化、矿物质骨病及尿毒症患儿生长迟缓的新靶点，从而改善CKD患者的生存质量和预后。