儿童骺板损伤非常常见，骨折、感染、恶性肿瘤或医源性损伤等原因均可导致，损伤后易引起生长阻滞、成角或旋转畸形，严重影响儿童的身心健康。目前临床骨桥切除术结合相应材料填充的治疗方法成功率低。采用软骨组织工程技术构建具有生物活性的骺板软骨成为治疗儿童骺板损伤新的研究方向。因此，现主要从组织工程三要素：种子细胞、生长因子、组织工程支架角度对目前骺板软骨的再生研究进行综述。
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骺板，又称生长板，为儿童未成熟长骨末端的软骨区域，是控制长骨纵向生长的重要结构。骺板损伤在儿童骨科十分常见，骨折、感染、恶性肿瘤或医源性损伤等原因均可导致[1,2,3]。一旦骺板损伤，骺板软骨组织将逐渐被骨组织代替，形成"骨桥"，并导致生长阻滞、成角或旋转畸形，甚至进一步影响关节功能，给儿童的身心健康带来巨大影响[4]。目前临床治疗方法主要为骨桥切除术结合相应的材料填充，以防止骨桥复发并允许周围未受损伤的骺板组织恢复骨骼纵向生长能力，尽管如此，这种治疗方法的成功率非常低，后期多需要接受截骨矫形或肢体延长等手术[5]，给家庭和社会增加了巨大负担。因此，采用软骨组织工程技术构建具有生物活性的骺板软骨成为治疗儿童骺板损伤新的研究方向，具有重大意义。
对组织损伤修复的研究首先需要对组织损伤部位的解剖、生理、病理变化有足够的认知，然后采取措施阻止或逆转这种病理改变并且引导其恢复正常生理状态是再生修复医学的最佳策略。骺板是位于长骨骨干和干骺端间的复杂软骨组织，近端远端均存在。骺板从关节至骨干方向依次被分为4个区域：静止区、增殖区、肥大区、钙化区[4]。由于骺板独特的解剖生理学构造，导致骺板极易受到损伤且损伤后受损的骺板软骨组织被骨组织替代，形成骨桥。尽管骨桥的形成机制至今仍不完全清楚，多项动物实验研究发现骺板损伤后局部主要经历了4个阶段：炎症反应阶段、成纤维阶段、成骨阶段及重塑形阶段[6]。
因此，随着对骺板解剖生理学特征及骺板损伤后病理特点的深入认识，加之各种骺板损伤动物模型的成功构建，为利用组织工程学技术再生功能性骺板软骨提供了坚实的基础，本文从组织工程学三要素：种子细胞、生长因子、组织工程支架角度对目前骺板软骨的再生研究进行综述，以期为骺板损伤的组织工程学疗法提供参考。
进行组织工程治疗首先需要选择特定的种子细胞，目前主要尝试植入软骨细胞及骨髓间充质干细胞(BMSC)作为种子细胞。
多年以前就已有一些使用软骨细胞移植治疗骺板损伤的实验，均取得了一定的治疗效果。而近年也有一些较新的软骨细胞移植实验，如Otsuki等[7]在家兔模型上进行的异体肋软骨移植实验，将实验动物分为不手术、仅手术切除而不填充、骨蜡填充、软骨细胞填充4组，结果显示软骨细胞移植取得了相对较好的治疗效果，但值得注意的是此实验使用的软骨来自异体，而取得较骨蜡组治疗效果好的时间也较晚，并且也未与其他的种子细胞进行对比研究。而Tomaszewski等[8]的实验则使用了自体软骨细胞，通过手术获取新西兰白兔软骨细胞后在体外经过处理与培养后，用于治疗骺板损伤并取得了成功，然而此实验中培养软骨细胞消耗的时间较长。Lee等[9]的实验同样使用了异体软骨组织，但他们将其培养为软骨组织类似物(CTA)后用于治疗，此方法的优势在于无需使用支架，可以避免支架植入可能导致的不良影响，但由于实验动物数量较小，仍需要更多长期试验进一步确定治疗效果。因此总体而言，自体软骨细胞的获取来源较为有限，且培养的过程也容易错过最佳治疗时间，如果使用异体软骨细胞，又有增加供受体间疾病传播的风险，因此软骨细胞移植具有一定的局限性。
相较于软骨细胞的局限性，干细胞有着许多优点，其可以分化为软骨、骨、脂肪等多种细胞，并且在人体内来源广泛，较易获取，包括骨髓来源的、脂肪来源的、脐带血来源的等，因此现在的研究更多集中在干细胞上。而BMSC相比于其他干细胞具有更好的增殖能力并且有更好的软骨特异性基因表达，因此可以作为骺板组织工程治疗理想的种子细胞。因此在Li等[10]的研究中，就成功使用BMSC对新西兰白兔模型进行治疗，不仅防止了骨桥的出现，还矫正了成角畸形与长度差异。McCarty等[11]则尝试使用BMSC治疗绵羊骺板损伤，但是除了阻止骨桥出现外，并未能促进骺板的修复，而是生成了纤维组织，当然，在大型动物模型上进行的研究相对较少，因此仍需更多实验以继续深入研究其治疗效果。
软骨细胞和BMSC作为目前研究较多的2种种子细胞，有研究者对二者的治疗效果进行了实验对比，其使用兔骺板损伤模型，分别使用了同种异体MSCs和软骨细胞进行治疗，并通过影像学、组织学、免疫组织化学对治疗效果进行评估，结果发现二者均取得了一定的治疗效果，且治疗效果并无显著的差别[12]。但是类似的将二者进行对比的实验数量较少，仍需要更多研究以确定二者的治疗效果是否有差别。此外还可以尝试将软骨细胞与MSCs混合进行实验治疗，但应与2种种子细胞分别单独治疗进行对比实验，也许可以达到更好的治疗效果。
总体而言，作为目前研究重点的MSCs，尤其是BMSC，具有来源广易获取等优点，同时也可以自我更新并且可分化，与软骨细胞相比，可能拥有更广阔的应用前景。
骺板实现其控制长骨纵向生长的功能需要诸多生长因子的参与，并依赖多条信号通路时序性调控，同样骺板损伤后骨桥形成病理过程中，以及自身修复过程同样存在多种生长因子和信号通路的改变。因此，目前软骨组织工程研究过程中生长因子可以分为两类：一类是促进成软骨分化进而维持骺板软骨生理特性的，另一类则是抑制成骨分化进而抑制骨桥形成病理过程的生长因子。遗憾的是，目前国内外大多再生骺板软骨的研究中均使用的是促进成软骨分化的生长因子，而忽略了从源头上抑制骨桥形成的生长因子的作用。
IGF-1是一个十分重要的生长因子，可以与生长激素共同促进正常生长，在骺板损伤修复过程中同样有多种作用。IGF-1所参与的IGF-1受体通路则是软骨细胞肥大的关键调节因子，可以影响甲状旁腺激素相关肽(PTHrP)与印度刺猬蛋白(Ihh)二者的作用，也可以增强转化生长因子β(TGF-β)的作用从而增加软骨细胞增殖[13]。Sundararaj等[14]制作了添加IGF-1的多孔聚乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)支架，并通过细胞培养实验及动物研究，证明了IGF-1可以在释放后修复损伤。在此基础上，Clark等[15]以仅使用PLGA支架，添加IGF-1或添加IGF-1与骨间充质细胞(BMC)，并与脂肪填充的对照组进行比较，最终结果显示软骨细胞数量从少到多分别为对照组、仅PLGA支架组、加入IGF-1组以及同时加入IGF-1与BMC组，这表明IGF-1具有促进骺板损伤修复的作用，也可以促进种子细胞生长。
TGF-β属于TGF-β超家族，由Ihh作用于软骨膜细胞后产生，可以促进软骨细胞的增生，并可促进MSC向软骨细胞的分化。体外实验表明，TGF-β在早期软骨形成中对诱导MSCs凝集起重要作用；在小鼠的实验中，出生时缺乏TGF-β2的小鼠表现为软骨发育不良。而TGF-β唯一的受体TGF-βRI的缺乏同样会导致软骨发育不良，这间接证明了TGF-β的重要性。此外TGF-β亚家族蛋白GDF1、10和11在发育生长板中均表达较高，其中GDF10最高，这表示其同样对生长板发育起重要作用[16]。而前文所提及的McCarty等[11]的实验即是使用TGF-β作为生长因子，而未能获得软骨细胞的再生与分化的原因，可能为损伤部位的炎症反应影响了TGF-β的活性[11]，因此仍需要更多实验进行验证其对损伤修复的影响及治疗效果。
骺板损伤后早期(第1-3天)即进入炎症阶段，TNF-α在此阶段起着主要作用，其在第1天达到峰值，随后逐渐下降，在第3天恢复至正常水平，但在第7天开始TNF-α又开始增加，并在成骨阶段以及重塑形阶段持续上升，这表明TNF-α与成骨同样有关[19]。Jimi等[20]则发现，TNF-α在炎症阶段可以与抗白细胞介素-1β(IL-1β)等其他炎症因子通过激活核因子κB激酶抑制剂β(IKKβ)共同参与调节核因子(NF)-κB信号通路，而NF-κB对调节骨形态发生蛋白-2(BMP-2)及早期软骨分化与软骨形成起重要作用，NF-κB1和NF-κB2被敲除小鼠的软骨细胞增殖显著降低。因此抗TNF-α具有十分重要的促进损伤修复的作用，可以终止骨桥形成的病理过程。
成骨和血管形成是骨骼生长、修复等过程中十分重要的过程，而VEGF是最重要的血管生长因子之一，参与了多个骨骼发育的过程。而Gruber等[21]发现，在损伤后第1、6、21天VEGF表达较多，并且随时间推移而逐渐降低，这表明血管变化是损伤后的早期事件。在Chung等[22]的实验中，使用有抗VEGF抗体作用的贝伐单抗进行治疗大鼠胫骨生长板损伤模型，与对照组相比，抗VEGF治疗除了使血管生成减少，还导致未分化的间充质修复组织增加，而在第14天损伤部位出现的骨组织较少，在第60天，抗VEGF处理的大鼠的生长板损伤诱导的胫骨长度减少更明显。这表明，除了影响血管生成外，VEGF同样可以影响骨组织的生长修复，而未来也许可以通过局部进行抗VEGF治疗抑制成骨反应及骨桥形成，并同时减少治疗药物的全身不良反应。
IL-1β与TNF-α一样在炎症反应阶段起重要作用，同样在Zhou等[19]的研究中发现，损伤后8 h IL-1β即达到峰值，并在第3天恢复至正常水平且基本维持。在Wang等[23]的实验中，培养了缺少IL-1β受体的小鼠，小鼠对IL-1β无反应并发育正常，同时发现IL-1β可以激活核苷酸寡聚结构域样受体3(NLRP3)炎性小体，从而引起炎症并导致生长板发育异常。但目前还没有抗IL-1β的治疗实验，也许这可以成为早期抑制炎症反应的新方法。
PKD可以调节osterix因子，osterix被认为是成骨细胞分化的重要转录因子，对正常的骨形成和骨修复至关重要。骨折愈合过程中成骨因子osterix的表达增加，osterix可促进骨性修复，而PKD对osterix具有上调作用。Chung等[24]为了研究PKD-osterix信号在损伤生长板的骨修复中的具体作用，在大鼠生长板损伤模型中使用了PKD抑制剂，发现生成的骨桥体积较对照组减少而间充质组织增加，这表明PKD可以抑制软骨形成并促进骨性修复。然而这其中的具体机制仍不明确，因此距离通过抗PKD抑制骨桥形成仍需要更多实验。
NT-3过去被认为是神经系统发育的关键因子，但Su等[25,26]的研究发现其在生长板损伤修复中具有潜在作用，NT-3在组织损伤后增加，NT-3可促进骨性修复，并且导致BMP-2和VEGF在抑制NT-3后损伤部位的血管化减少，因此NT-3可能是BMP-2和VEGF的调控因子，而在抑制NT-3后，损伤部位的血管和骨桥产生均减少。但还未见针对NT-3的治疗研究，因此需要进一步研究NT-3是否可能作为预防生长板骨桥生成的潜在靶点。
由上可见，各种生长因子和信号通路的调控网络极其复杂，在不同时间点、不同部位均体现出不同的作用，如何将多种生长因子混合，并能实现定时、定量、定点释放，将是后期研究的重点[27,28]。
在确定合适的种子细胞与生长因子后，另一个需要解决的问题就是合适的支架，支架主要为种子细胞提供了稳定的生长空间，合适的支架需要拥有良好的生物性质，具有可吸收性或可降解性，并且不会被植入部位排异，因此目前所使用支架多为天然物质，如琼脂糖、壳聚糖等材料，但也有研究探索新的合成材料，近年来利用3D打印技术制备的各种结构的仿生支架更使组织工程技术实现了突飞猛进的发展[4,6]。
在前文所述Chen等[29]的研究中，所使用的即是琼脂糖支架，结果也显示骨膜来源的MSCs包埋在琼脂糖支架中，可以减少生长板损伤导致的生长停滞，这是较早证明琼脂糖支架可行性的实验。但琼脂糖支架也有一些缺点，如生物稳定性不足，因此Zhao等[30]试图将此改进，制作了醋酸琼脂糖支架，并与外消旋聚乳酸支架进行了对比，发现醋酸琼脂糖支架降解速度更慢且不易引起炎症反应。
壳聚糖是一种天然的多糖，具有生物可溶性、可降解性等性质，因此同样适合作为组织工程支架。在Azarpira等[31]的研究中，建立了生长的板损伤的家兔实验模型，对比了仅使用壳聚糖与同时使用MSCs和壳聚糖对生长板损伤的治疗效果，显示单独使用壳聚糖并不能阻止骨桥生成，但同时使用MSCs和壳聚糖的实验组出现类似柱状分布的软骨细胞，并且未出现骨桥。但其他单独使用壳聚糖的实验很少，因此不能进一步确定其治疗效果。
在以上研究中，单一天然材料虽然均具有一定的治疗效果，可以使其中的种子细胞生长，但其中增殖的细胞并未按生长板特有的柱状结构排列，难以达到较好的临床治疗效果，因而单一天然材料支架可能无法满足使骺板恢复生长功能的需求。
Erickson等[32]的研究中，尝试使用了藻酸盐-壳聚糖支架，实验结果显示减少了骨桥形成，但也导致其他修复组织的减少，但本实验更重要的研究方向是支架的体内降解速度对组织修复的影响，因此不同实验组藻酸盐-壳聚糖比例不同，或使用了辐照壳聚糖，结果显示比例为9010并加入钙的实验组降解最慢并产生较多骨桥，5050并使用辐照壳聚糖的实验组降解最快并产生更多的软骨组织，因此表明，不同的支架降解速度可能可以影响损伤修复的过程[32]。
PLGA支架是一种较新的合成材料，Sundararaj等[14]的实验中即使用了加入IGF-1的PLGA支架，在经过体外的评估后植入了新西兰白兔胫骨生长板损伤模型，结果显示实验组有软骨组织再生，但并未按柱状结构排列，而对照组仅有骨桥形成。Clark等[15]则进行了进一步的实验，对比了仅PLGA支架、加入IGF-1的PLGA支架与加入MSCs和IGF-1的支架，并且发现3个实验组所产生的软骨细胞依次增加。这些实验都提示PLGA支架在生长板损伤治疗应用的可能性。
在生长板组织中，生长板软骨细胞生存于高度水合的ECM三维结构中。生长板来源的ECM富含多种生物活性蛋白和生长因子。ECM为各层次生长板细胞提供其生长所需要的微环境，不仅为细胞提供结构支持，还可对细胞的迁移、增殖、分化及基因的表达调控有重要作用。在其他器官组织修复研究中，ECM来源的组织工程支架已经成功为肌肉、骨骼、关节软骨等组织再生提供了可能[33,34,35]。而生长板来源的ECM作为生长板组织工程支架材料在生长板组织结构重建中有着不可比拟的优势，其富含的活性蛋白和生长因子能够高效引导生长板软骨细胞分化再生从而促进生长板修复。Melrose等[36]概述了在生长板ECM中的一些重要成分，包括胶原蛋白、蛋白聚糖、糖胺聚糖、生长因子、蛋白酶等，并讨论了他们在生长板生长发育过程中所起的重要作用。Li等[10]使用脱细胞生长板软骨ECM制作的定向支架用于治疗新西兰白兔生长板损伤模型，结果显示支架形成纵向柱状结构，细胞在其环境中良好生长，与支架结合紧密，形成类似软骨样组织，并且没有骨桥形成。尽管如此，单纯ECM成分直接作为支架材料时由于机械强度不足，植入后易发生塌陷，无法作为支架主体承载种子细胞进行生长板修复的作用，并且难以根据应用的需要进行设计和调控，一直限制了其优质的原生成分的应用。而加入人工合成的高分子材料可以调控其理化性质，使其更符合细胞的ECM环境。
近年来随着对关节软骨梯度化微观结构的深入研究，对软骨组织工程研究的目标已经从再生单一结构的软骨演变为再生具有梯度分层结构的软骨[37]，研究发现支架孔径的梯度变化可以实现细胞密度和ECM的梯度变化[38]。生长板软骨细胞具有独特的分层柱状结构，各层具有不同的细胞与ECM，生长板组织生物学功能的发挥依赖于其特殊的细胞形态及典型的柱状排列结构[13,39]，因此对支架结构进行精细设计和调控，最大程度模拟自然生长板软骨的微结构和微环境，可以更好地实现稳定可靠的生长板软骨修复。而目前国内外研究中的生长板组织工程支架的三维结构多不符合生长板组织的生理结构特点，无法完全发挥促进肢体生长的生物学功能，不能实现真正的功能性生长板组织修复[7]。传统的支架制备方法难以实现对支架微结构的调控，而利用计算机辅助设计和3D打印技术可制备出与天然生长板结构类似的支架，实现细胞与ECM在微观尺度的排列分布，有助于调节细胞行为、细胞间的相互作用、细胞与材料间的相互作用，以及促进细胞最终形成功能组织[40,41]。因此，3D生物打印技术理应可以协助解决调控支架微结构的难题。尽管3D打印支架拥有广阔前景，目前还没有将3D打印支架应用于生长板软骨再生医学的研究，这将是未来几年内最热门的研究方向之一。
总之，利用组织工程学技术再生修复骺板软骨，主要利用软骨细胞和/或BMSC结合特定材料的支架实现软骨再生。虽然先前做了大量研究，利用不同的种子细胞、筛选不同类型的生物活性材料及调控方法，但仍然面临支架成软骨效率低，再生软骨与周围正常组织融合较差的问题。更重要的是再生软骨不具有类似天然骺板的分层结构，无法控制长骨纵向生长。这种情况的关键原因主要为以下两点：(1)支架微组成方面：目前关于支架的微组成方面研究主要集中在如何促进成软骨分化再生软骨组织这一方向，忽略了损伤早期从源头上阻止骺板损伤后局部成骨分化与骨桥形成；(2)支架微结构方面：目前组织工程支架的微结构多不符合骺板的生理结构特点，致使再生软骨细胞呈无序堆积状态，无法发挥其控制成骨纵向生长的生物学功能。3D打印组织工程支架能够有效设计控制支架的微观结构和理化性质，理应可以为解决儿童骺板损伤修复的难题提供新的思路。
所有作者均声明不存在利益冲突
