探讨不同类型的钠离子通道基因突变相关早发性癫痫脑病(EOEE)患儿的临床表型特点。
采用回顾性研究。选取2016年6月至2019年6月复旦大学附属儿科医院神经内科和华中科技大学同济医学院附属武汉儿童医院神经内科收治的52例患儿，采集患儿及其父母外周血，应用疾病基因家系全外显子二代测序及拷贝数变异技术进行测序分析，寻找致病突变。不同电压门控钠通道α1亚基(SCN1A)突变类型间癫痫发作控制数据比较采用χ2检验。
52例患儿中35例(35/52例，67.3%)诊断为Dravet综合征、3例(3/52例，5.8%)婴儿痉挛症、14例(14/52例，26.9%)非综合征类EOEE。脑电图提示多量多灶性棘波、棘慢波、尖波、尖慢波发放。45例(45/52例，86.5%)头颅磁共振成像(MRI)提示正常，1例双侧额叶脑沟稍增宽，1例双侧颞极、额顶部蛛网膜下腔增宽，余5例脑外间隙增宽、脑室稍大。后期13例患儿复查头颅MRI，其中3例患儿轻度脑萎缩。52例患儿中SCN1A突变43例(43/52例，82.7%)，其中28例(28/52例，53.8%)为错义突变、5例(5/52例，9.6%)无义突变、7例移码突变(7/52例，13.5%)、3例(3/52例，5.8%)剪切位点突变。SCN2A突变3例(3/52例，5.8%)，其中2例(2/52例，3.8%)错义突变，1例(1/52例，1.9%)移码突变。SCN3A突变1例(1/52例，1.9%)，为错义突变。SCN8A突变5例(5/52例，9.6%)，均为错义突变。治疗后平均随访1年，发作控制1年以上者13例(13/52例，25.0%)，其中发作控制2年以上者6例(6/52例，11.5%)，3年以上者4例(4/52例，7.7%)。分析SCN1A突变类型与癫痫发作控制程度，发现SCN1A错义突变较SCN1A截断突变(无义突变+移码突变)患儿癫痫发作相对易控制(P<0.05)。5例SCN8A突变患儿中，2例添加奥卡西平后，发作控制1年以上，智力运动功能改善不明显。
钠离子通道基因突变相关EOEE患儿中，SCN1A、SCN2A、SCN3A、SCN8A的遗传变异是EOEE遗传学病因的重要因素，以SCN1A最为多见，突变率高达82.7%。Dravet综合征是钠离子通道基因突变相关EOEE最常见临床表型。SCN1A错义突变患儿较截断突变患儿癫痫发作相对容易控制，提示基因突变类型与发作控制程度相关。奥卡西平添加治疗SCN8A脑病患儿有效，提示EOEE依然可根据基因功能类型选择联合用药。
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早发性癫痫脑病(early-onset epileptic encephalopathy，EOEE)是一组在出生后数周至数月内起病的难治性癫痫，频繁的癫痫样放电导致逐渐加重的认知语言及运动发育障碍。癫痫病因分为6大类：感染性、免疫性、结构性、代谢性、遗传性和不明原因。遗传性病因中单基因变异解释至少20%~30%的癫痫性脑病的发生[1]。癫痫基因的功能改变分为功能获得型和功能丧失型，包括基因编码的离子通道：钠离子通道、钾离子通道、钙离子通道、超极化激活的周期性核苷酸门控钾通道等。基因编码的蛋白通过影响突触囊泡释放，细胞内/细胞间的信号转导，神经递质膜受体，细胞内转运蛋白及酶类[2]来影响功能。EOEE中离子通道基因突变最为常见，其中又以钠离子通道基因突变较为常见。本研究探讨钠离子通道基因突变相关EOEE的分子遗传学特点，分析其基因型与临床表型特征，提高临床认识，为进一步精准治疗奠定基础。
选择2016年6月至2019年6月在复旦大学附属儿科医院神经内科和华中科技大学同济医学院附属武汉儿童医院神经内科收治的52例患儿。入组标准：(1)出生6个月内癫痫发作；(2)发作频繁，常规联合多种抗癫痫药物(AEDs)难以控制；(3)智力运动发育落后、停滞或倒退。排除标准：(1)围生期脑损伤；(2)代谢病；(3)宫内感染；(4)头颅影像学提示脑结构异常导致的新生儿期及婴儿期癫痫发作。利用基因二代测序技术家系全外显子测序加拷贝数变异分析，对入组患儿进行相关基因突变筛查，筛选出钠离子通道基因突变阳性的患儿，并除外其他已知与EOEE相关的基因。本研究通过复旦大学附属儿科医院和华中科技大学同济医学院附属武汉儿童医院医学伦理委员会批准[批准文号：2016(117)、2016(450)]，患儿监护人均签署知情同意书。
采用回顾性研究。收集患儿临床资料，包括临床症状体征、血液生化检查、脑电图、头颅影像学、血串联质谱、尿有机酸分析、染色体核型分析、治疗转归及预后随访情况。
应用微阵列比较基因组杂交技术行家系拷贝数变异检测，并利用基因二代测序技术行家系全外显子组测序分析。采集患者外周乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝静脉血4 mL，采用BloodGen Midi Kit DNA提取试剂盒提取全基因组DNA，操作按试剂盒说明书进行。建立文库，对全部相关基因的编码区，包括外显子及外显子与内含子的交界区进行测序分析。
(1)微缺失或微重复，其中涉及钠离子通道基因突变；(2)插入或缺失突变；(3)编码氨基酸的改变或终止密码子的改变；(4)剪接位点的改变；(5)非同义突变并通过Polyphen2软件预测此突变可能破坏蛋白功能。
(1)微缺失或微重复，其中未涉及钠离子通道基因突变；(2)正常对照中均存在的核苷酸变异；(3)同义突变；(4)在人类基因突变数据库(HGMD)、千人基因组数据库、PubMed数据库及UCSC数据库中已标注的单核苷酸多态性(SNP)。
突变基因所验证位点序列设计引物，采用聚合酶链式反应(PCR)方法进行扩增。PCR反应条件：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，64 ℃退火30 s，72 ℃链延伸40s，扩增30个循环；72 ℃补充延伸10 min。PCR的体系均为50 μL。
通过门诊、再入院及电话进行随访。每3~6个月评估1次病情。随访患儿癫痫发作、认知运动功能等情况。
应用SPSS 23.0软件，计数资料采用例数和百分数(%)描述，患儿癫痫发作年龄等计量数据采用范围(
±s)表示，2组不同电压门控钠通道α1亚基(SCN1A)突变类型间癫痫发作控制数据比较采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。
52例患儿中，男30例，女22例；4例早产儿，其余均为足月儿；癫痫发作年龄3 d~6个月[(3.5±1.5)个月]；就诊年龄3 d~8岁；父母均为非近亲结婚，患儿间无亲缘关系。热性惊厥家族史4例(7.7%)，癫痫家族史3例(5.8%)，精神疾病家族史3例(5.8%)。52例中，35例(67.3%)诊断为Dravet综合征、14例(26.9%)非综合征类EOEE、3例(5.8%)婴儿痉挛症。
52例患儿中，首次就诊时仅出现1种癫痫发作形式23例：18例局灶性发作(3/52例，34.6%)，3例痉挛发作(3/52例，5.8%)，1例强直发作(1/52例，1.9%)，1例强直阵挛发作(1/52例，1.9%)。首次就诊时出现2种及2种以上癫痫发作形式29例：8例强直发作、局灶性发作(8/52例，15.4%)，5例强直发作、肌阵挛发作(5/45例，9.6%)，5例强直发作、局灶性发作、痉挛发作(5/52例，9.6%)，4例强直发作、局灶性发作、痉挛发作、肌阵挛发作(4/52例，7.7%)，4例局灶性发作、痉挛发作(4/52例，7.7%)，3例强直发作、失张力发作(3/52例，5.8%)。
52例患儿初次就诊时脑电图，10例(10/52例，19.2%)脑电图提示发作间期背景慢波活动增多，睡眠期多量多灶性棘波、棘慢波发放，其中5例监测到局灶性发作，为广泛棘波、棘慢波发放。18例(18/52例，34.6%)发作间期清醒期及睡眠期大量多灶性棘波、尖波、尖慢波发放，其中5例监测到肌阵挛发作，为广泛多灶性棘波、尖波、尖慢波发放，4例监测到局灶性发作、痉挛发作。3例(3/52例，5.8%)脑电图改变为发作间期高度失律，监测到成串或孤立性痉挛发作。11例(11/52例，21.2%)脑电图提示发作间期清醒期及睡眠期全导棘波、棘慢波发放，其中2例双侧中央、顶及中线区2例。5例(5/52例，9.6%)发作间期清醒期及睡眠期弥漫性慢波夹杂多灶性棘波、尖波、多棘波发放，其中以后头部突出2例。5例(5/52例，9.6%)脑电图提示发作间期清醒期及睡眠期大量多灶性尖波、尖慢波发放。
52例患儿中，初期就诊时45例(45/52例，86.5%)头颅磁共振成像(MRI)提示正常。2例双侧侧脑室稍大，1例双侧外侧裂及额部脑外间隙增宽，1例脑外间隙增宽，1例双侧额叶脑沟稍增宽，1例双侧颞极、额顶部蛛网膜下腔增宽，1例双侧脑室稍大、左颞极及双额脑外间隙增宽。后期平均间隔1~2年，13例患儿复查头颅MRI，其中3例患儿轻度脑萎缩。
52例患儿均常规行染色体核型分析，均提示正常核型，未见染色体重复或易位等异常。52例均行家系拷贝数变异检测和全外显子组测序分析，未发现包含钠离子通道基因相关的拷贝数变异。家系全外显子测序分析提示SCN1A突变43例(43/52例，82.7%)，其中28例(28/52例，53.8%)错义突变、5例(5/52例，9.6%)无义突变、7例移码突变(7/52例，13.5%)、3例(3/52例，5.8%)剪切位点突变。28例(28/52例，53.8%)SCN1A错义突变中，23例(23/52例，44.2%)为新发错义突变，余5例突变来自父亲，该5例患儿父亲幼时有发热或无热抽搐病史。7例SCN1A移码突变中，6例(6/52例，11.5%)为新发移码突变，余1例突变来自父亲，父亲幼时有抽搐病史。5例SCN1A无义突变、3例SCN1A剪切位点突变均为新发突变。电压门控钠通道α8亚基(SCN8A)突变5例(5/52例，9.6%)，均为新发杂合错义突变，蛋白功能均预测为有害。电压门控钠通道α2亚基(SCN2A)突变3例(3/52例，5.8%)，其中2例(2/52例，3.8%)为新发杂合错义突变，1例(1/52例，1.9%)为新发移码突变。电压门控钠通道α3亚基(SCN3A)突变1例(1/52例，1.9%)，为新发杂合错义突变。
43例SCN1A突变中，35例明确诊断为Dravet综合征，8例为非综合征类早发性癫痫脑病。首次发作年龄为3~6个月，发作形式包括局灶性发作、强直发作、肌阵挛发作，均使用丙戊酸、左乙拉西坦、氯巴占、氯硝西泮、大麻二酚、生酮饮食等2种及2种以上。其中28例杂合错义突变中，10例患儿癫痫发作控制良好，1~2年发作1次，多在发热时诱发发作。18例仍间断抽搐，癫痫发作控制欠佳，每天发作数次至每月发作次数。7例移码突变、5例杂合无义突变、3例剪切位点突变患儿癫痫发作均未控制，智力运动落后严重。进一步分析SCN1A突变类型与癫痫发作控制程度，发现SCN1A错义突变比SCN1A截断突变患儿癫痫发作相对容易控制，差异有统计学意义(P<0.05)；SCN1A错义突变与SCN1A剪切位点患儿的癫痫发作控制比较差异无统计学意义(P>0.05)。结果见表1、图1。
钠离子通道基因突变相关早发性癫痫脑病患儿SCN1A突变类型与癫痫发作控制程度分析 (例)
Analysis of SCN1A mutation type and seizure control in children with early-onset epileptic encephalopathy associated with sodium channel gene mutations (case)
钠离子通道基因突变相关早发性癫痫脑病患儿SCN1A突变类型与癫痫发作控制程度分析 (例)
Analysis of SCN1A mutation type and seizure control in children with early-onset epileptic encephalopathy associated with sodium channel gene mutations (case)
| 癫痫发作控制 | 例数 | SCN1A错义突变 | SCN1A截断突变 | SCN1A剪切位点 |
|---|---|---|---|---|
| 良好 | 10 | 10 | 0 | 0 |
| 欠佳 | 33 | 18 | 12 | 3 |
| χ2值 | 5.714 | 1.582 | ||
| P值 | 0.017 | 0.209 |
注：SCN1A截断突变(SCN1A无义突变+移码突变) SCN1A truncation mutation (SCN1A nonsense mutation + frameshift mutation)
3例SCN2A突变患儿中，2例为杂合错义突变，其中1例为婴儿痉挛症，口服泼尼松龙及丙戊酸发作控制；另1例为非综合征类EOEE，发作形式有局灶性发作、强直发作，口服托吡酯、左乙拉西坦、奥卡西平，仍有发作，每月发作1~2次。1例为移码突变，为非综合征类EOEE，发作形式有局灶性发作、强直发作，且有丛集性发作，曾使用丙戊酸、拉莫三嗪、托吡酯、左乙拉西坦、奥卡西平、生酮饮食，抽搐均难以控制，后行迷走神经刺激器置入术，发作有所好转。
1例SCN3A新发杂合错义突变患儿，为婴儿痉挛症，曾使用促皮质素(ACTH)、丙戊酸、托吡酯、左乙拉西坦、奥卡西平、生酮饮食等抗癫痫治疗，发作仍未控制。
5例SCN8A突变患儿，均为新发杂合错义突变，其中4例为非综合征类EOEE，1例为婴儿痉挛症。婴儿痉挛症患儿使用甲泼尼龙、托吡酯、ACTH、奥卡西平，发作未控制。4例非综合征类EOEE患儿，其中1例使用左乙拉西坦、氯硝西泮、托吡酯发作未控制，加用奥卡西平后发作控制；另1例使用左乙拉西坦发作未控制，加用奥卡西平后发作控制；余2例中，1例使用左乙拉西坦、奥卡西平、氯硝西泮、托吡酯，发作未控制，1例使用维生素B6、托吡酯、奥卡西平、生酮饮食发作未控制。
治疗后平均随访1年，发作控制1年以上13例(13/52例，25.0%)，其中发作控制2年以上6例(6/52例，11.5%)，3年以上4例(4/52例，7.7%)。43例SCN1A突变患儿的28例杂合错义突变中，11例患儿癫痫发作控制至少1年以上，再次发作诱因为发热，平均1~2年发作1次，均在发热时出现。其中发作控制2年以上6例，3年以上3例。发作控制的患儿随访中智力运动功能均有所进步。43例SCN1A突变患儿中的7例移码突变、5例杂合无义突变、3例剪切位点突变患儿，后期发作均仍未控制，且智力运动损害明显。
3例SCN2A突变患儿，其中2例患儿发作未控制，每周至每月发作2~3次。另1例为婴儿痉挛症，脑电图提示高度失律，口服泼尼松龙及丙戊酸发作控制，发作控制3年以上，后一直口服丙戊酸抗癫痫治疗，智力运动功能较前进步。1例SCN3A突变患儿发作未控制，每周发作2~4次，且智力运动损害明显。
5例SCN8A突变患儿中，2例添加奥卡西平后，发作控制1年以上，智力运动功能改善不明显；另2例联合奥卡西平等多种AEDs治疗后发作未控制，且智力运动损害明显；1例为婴儿痉挛症，联合使用奥卡西平等多种AEDs发作未控制。
离子通道是由细胞产生的特殊蛋白质构成，根据其活化方式不同，分为2类：一类是电压活化的通道，即通道开放受膜电位控制，如钠离子、钾离子、钙离子和氯离子通道；另一类是化学物活化的通道，即靠化学物与膜受体相互作用而活化的通道，如乙酰胆碱受体通道、氨基酸受体通道等。离子通道的特点主要是离子主动运输梯度流动以保持静息电位，其基因选择性在大脑高度表达，通过影响动作电位的异常产生、抑制和扩散，导致致病，主要表现为癫痫发作，不同的离子通道病有重叠的表型特征[3]。
与癫痫相关的离子通道可分为电压门控通道：钠离子通道、钾离子通道、钙离子通道等配体门控通道：γ氨基丁酸受体、乙酰胆碱受体、抗N-甲基-D-天冬氨酸受体；离子泵。其中电压门控钠通道(voltage-gated sodium channels，VGSC)对于整个神经系统中动作电位的产生和协调传递至关重要，已被证明在癫痫的发生和缓解中起核心作用。对癫痫患者的遗传研究已经发现，编码VGSC的基因中有700多个突变证明了其在发病机制中的作用[4]。有9个不同的成孔性α亚基(NaV1.1~1.9由SCN1A~SCN5A和SCN8A~SCN11A基因编码)，每个α亚基均由1个单一的260 kDa蛋白质组成，该蛋白质由4个重复结构域(Ⅰ~Ⅳ)组成，每个结构域均包含6个跨膜α螺旋区段(S1~S6)。国外研究表明编码4个神经元电压门控钠离子通道NaV1.1、NaV1.2、NaV1.3和NaV1.6的基因SCN1A、SCN2A、SCN3A、SCN8A中的遗传变异是早发性癫痫脑病遗传学病因的重要因素[5]。本研究52例患儿中发现钠离子通道相关EOEE突变基因为SCN1A、SCN2A、SCN3A、SCN8A，未见其他钠离子通道基因，与国外研究一致[5]。且以SCN1A最为多见，突变率高达82.7%。
钠离子通道基因突变相关EOEE常见临床表型，综合征类EOEE以Dravet综合征为首，高达67.3%，其次为婴儿痉挛症，占5.8%，其余为非综合征类EOEE。但总体看来非综合征类EOEE居第2位，占26.9%，表明Dravet综合征并非EOEE唯一临床表型，仅是钠离子通道基因突变相关EOEE临床表型之一，但为最常见临床表型。在Cetica等[6]研究中，0~6个月年龄组患Dravet综合征的风险为85%，在6~12个月范围内为51%，在第12个月后为0，在第6个月内发病是诊断为Dravet综合征进展的临界值。本研究发现6个月内钠离子通道基因突变相关的EOEE仍以Dravet综合征多见。本研究发现SCN2A、SCN3A、SCN8A突变相关的EOEE可有重叠表型，均可有痉挛发作。国外学者也报道SCN2A、SCN3A、SCN8A突变相关的EOEE可有婴儿痉挛症表型[7,8,9,10,11]。SCN1A突变相关的EOEE并未发现婴儿痉挛症表型，仍以Dravet综合征和非综合征类EOEE为主。
钠离子通道基因突变相关EOEE中，癫痫发作形式多样，脑电图多表现为大量多灶性放电、高度失律等，无明确规律可循。但某些脑电图特征与EOEE综合征类型有关，如高度失律可见于婴儿痉挛症。未明确归类为综合征的钠离子通道基因突变相关EOEE，其癫痫发作形式多种多样，脑电图也呈现为大量多灶性放电，无明确规律可循。所有患儿头颅影像学检查中，头颅MRI除脑外间隙增宽常见外，无明显其他异常。仅后期有少数患儿出现轻度脑萎缩，考虑与长期癫痫发作有关。
尝试基于已知的SCN1A点突变进行基因型与表型相关性的研究，基因型与表型相关性并不一致。一些研究检查了几个变异特征，如基因突变类型截断突变与错义突变，SCN1A通道中氨基酸取代的位置及氨基酸取代的类型，尽管在某些人群的分析中已发现Dravet综合征与毛孔区域的截断突变或错义突变之间可能存在关联[5,12]，但无确凿证据证实明确的关联性。本研究发现SCN1A错义突变患儿癫痫发作较截断突变相对易控制，截断突变癫痫发作相对较难控制，提示基因突变类型与发作控制可能相关，但本研究样本量偏小，仍需大样本进一步验证。
目前关于某些错义突变为何表现出严重表型的确切原因尚不明确。在特定领域中错义突变的聚类也一直是分析和有争议的解释的对象。Ishii等[13]描述了与对照人群中观察到的变异相比，Dravet综合征患者中特定SCN1A区域错义突变的富集尤其在充当电压传感器的S4段和充当孔环的S5~S6段中发现了富集DⅢ和DⅣ。但是，尽管S5~S6孔区域中的突变会导致功能完全丧失，类似于单倍体功能不足，但在Dravet综合征和遗传性癫痫伴热性惊厥附加征中均可找到它们，因此又影响了不同表型严重程度的区分[14]。
Brunklaus等[5]分析了114个钠离子通道突变相关癫痫的功能特性，确定了53种经电生理测试的SCN1A，31个SCN2A、5个SCN3A和25个SCN8A突变，发现多数SCN1A癫痫相关突变(75%)表现出NaV1.1通道的功能丧失型，而少数表现出混合效应(25%)。SCN2A/3A/8A相关癫痫多为功能获得型。SCN1A功能丧失型与Dravet综合征和遗传性癫痫伴热性惊厥附加征相关，而功能获得型突变与家族性偏瘫偏头痛3型相关。然而，相应的功能丧失型SCN2A和SCN8A突变导致神经发育障碍，而功能获得型突变导致EOEE[5]。结合本研究52例患儿，多数患儿基因均为新发突变，部分为未报道突变位点，部分已被报道，但相关位点的功能并未验证，拟后续进一步做动物实验，进行功能验证。
钠离子通道基因突变相关EOEE总体治疗效果差，常联合多种AEDs，癫痫发作仍难以控制。总体发作控制率1年以上占25%，控制率较低。早有研究表明，钠通道阻滞剂对功能丧失型突变类型效果并不好，但对功能获得型突变类型有效[15,16,17,18,19,20,21,22,23]。本研究发现5例SCN8A突变患儿中的2例添加奥卡西平发作控制，智力运动功能改善。而余3例SCN8A突变患儿及1例SCN2A、1例SCN3A突变患儿添加奥卡西平治疗效果欠佳，考虑可能与基因突变功能类型有关，强调了EOEE依然可根据基因功能类型选择联合用药的治疗思路。
所有作者均声明不存在利益冲突
