近年来研究人员对于外泌体相关研究的热度逐渐提高，外泌体源性微小RNA(exo-miRNA)已作为极具潜力的非侵入性生物标志物广泛用于早期临床诊断研究中。血液中含大量血小板、动脉内皮细胞和其他细胞类型释放的外泌体，且外泌体外部膜还具有保护exo-miRNA等内容物免受生物酶水解、稳定存在于人体体液中的独特优势，这些特点使外泌体及exo-miRNA在心血管疾病早期诊断、促进细胞再生、心脏保护等方面发挥出巨大作用。现就外泌体的结构和生物发生方式、exo-miRNA的作用机制及其在儿童心血管相关疾病治疗中的研究进展进行综述。
版权归中华医学会所有。
未经授权，不得转载、摘编本刊文章，不得使用本刊的版式设计。
除非特别声明，本刊刊出的所有文章不代表中华医学会和本刊编委会的观点。
细胞外囊泡(EV)是由膜覆盖的囊泡，是由原核生物、高级真核生物、植物细胞以进化保守的方式释放而成的。根据其释放特点与体积大小，EV可分为3类亚型：通过质膜向外发芽裂变的微囊泡、以凋亡细胞的气泡形式释放的凋亡小体及由内体形成并在多囊泡体与质膜融合后释放的外泌体[1]。外泌体是直径为30~150 nm的细胞外脂质双层囊泡，胞内多泡小体与胞膜向内凹陷融合后，以外分泌形式释放到细胞外而分泌的胞外囊泡[2]，其外部膜还有保护外泌体源性微小RNA(exo-miRNA)等内容物免受生物酶水解、稳定存在于人体体液中的独特优势[3]。1983年科学家们首次在大鼠网织红细胞体外培养过程中发现了细胞可释放出这种细胞外囊泡，并于1987年在绵羊网织红细胞中提取得到，且正式将其命名为外泌体[4]。近年随着对exo-miRNA的认识不断加深，exo-miRNA开始被作为一种新兴的诊断标志物及治疗手段运用于科研及临床的各大领域，并取得了明显进展，现就exo-miRNA在儿童心血管系统疾病的相关研究进展作简要综述。
外泌体的释放需经过3个步骤：晚期多囊体(MVB)中形成腔内囊泡(ILV)，MVB转运至质膜，MVB与质膜融合[5]。研究表明，各种哺乳动物细胞，如血小板、白细胞、上皮细胞、肿瘤细胞等均可分泌外泌体，且外泌体还具有稳定存在于各种动物生理或病理性体液，如血浆、血清、尿液、唾液、腹水、羊水、精液中的特性[6]。
外泌体可通过表面分子靶向将内容物转运至目标细胞来改变细胞生理状态，从而介导细胞间信号传导和信息交流[7]，也可通过将其生物活性物质转移到受体细胞或激活靶细胞中的信号传导通路辅助完成细胞间通讯。外泌体的外部膜结构则可保护外泌体内容物免受生物酶水解，稳定存在于人体体液中。
外泌体蛋白质组学的分析研究主要集中在鉴定高度丰富的囊泡蛋白上，目前研究者们成功通过凝胶电泳分离纯化出特异性蛋白质，通过质谱分析内含蛋白来帮助鉴定外泌体标志蛋白，如四肽、14-3-3蛋白、肌动蛋白、转膜蛋白、融合蛋白、四跨膜蛋白和热休克蛋白等[8,9]。其中四跨膜蛋白(如CD9、CD63、CD81和CD82)和囊泡运输相关蛋白[多泡蛋白小体(TSG101)、凋亡诱导因子6相互作用蛋白抗体(ALIX)、RAB蛋白、syntenin-1]已被普遍鉴定为外泌体囊泡蛋白中的特异蛋白[10]。
miRNA是一类由内源基因编码的长约22个核苷酸的单链RNA分子，可通过阻断体内蛋白质翻译或诱导mRNA降解来抑制靶基因的表达[11]。研究表明，外泌体中存在大量miRNA，这些RNA可稳定存在于外泌体囊泡中，且在适宜温度、湿度条件下稳定保存48 h[12]。数据显示，血液、体液中exo-miRNA的丰度和稳定性明显高于游离的miRNA，这无疑为体液源性exo-miRNA作为生物标志物提供了更多可能[13]。相关研究表明，外泌体可自行选择包裹特定的RNA分子，参与相关受体细胞通讯，从而发挥体内调控作用[14]。
exo-miRNA主要通过3种途径进行释放：(1)从细胞释放到MVB内的细胞外环境中与MVB结合并通过外泌体分泌；(2)以高密度脂蛋白(HDL)颗粒为载体释放；(3)与RNA结合蛋白结合，以miRNA-蛋白复合物的形式释放[15]。
HF是各种心脏结构或功能障碍引起心室充盈或射血功能受损，心排血量减少而导致的循环淤血、组织器官灌注不足为主的综合征，也是多数心血管疾病的共同终点。发生于儿童的HF通常是儿童心脏术后的低心排综合征、暴发性心肌炎、川崎病(KD)导致的冠状动脉损伤及感染性心内膜炎的继发性HF。儿童HF是儿科常见急症，因此，如何找到特异性高的无创生物标志物极为重要。
Ding等[16]通过对成人HF患者建模证明，在HF发生后的运动康复中，exo-miR-222的表达水平较正常情况升高，且能通过p27、同源结构域相互作用蛋白激酶1(HIPK-1)、同源结构域相互作用蛋白激酶2(HIPK-2)和同源异形盒1(HMBOX1)的直接靶向作用促进HF后的心肌肥大、增殖和存活，防止病理性心脏重塑的发生[17]。Wang等[18]通过检测成人HF患者血浆外泌体证明，miR-21、miR-425和miR-744含量均显著上调，血浆中exo-miR-425和exo-miR-744有望成为预测心脏纤维化和HF的生物标志物；该课题组还发现，上述2种miRNA还可通过抑制转化生长因子-β(TGF-β)表达来充当心脏纤维化的负调节剂，减缓心脏纤维化的进程。
左心室射血分数(LVEF)≤40%被定义为射血分数降低的HF(HFrEF)，较其他类型的HF死亡率明显升高。Wu等[19]通过定量检测HFrEF患者的血清水平发现，exo-miR-92b-5p水平可作为HFrEF诊断的标志物；该课题组后续研究证明，血清exo-miR-92b-5p也是扩张型心肌病导致急性心力衰竭(DCM-AHF)的潜在生物标志物。Matsumoto等[20]研究表明，参与p35应答的有3种miRNA(miR-192、miR-194、miR-34a)，其中miR-194、miR-34a主要存在于心肌细胞的外泌体中，这3种exo-miRNA在缺血性HF的急性心肌梗死(AMI)患者血清中显著上调，这表明以上3种exo-miRNA可作为发生缺血性HF的AMI患者的诊断标志物，还可通过p53途径充当循环调节因子参与调节AMI后代偿期的心室舒张能力。
Li等[21]通过提取慢性心力衰竭(CHF)成人患者血浆和心脏样品中总RNA发现，3种心脏成纤维细胞源性的exo-miRNA(miR-660-3p、miR-665、miR-1285-3p)在CHF患者体内显著上调，其丰度还与CHF严重程度相关，说明这3种miRNA不仅有望成为CHF的特异性诊断生物标志物，而且还可通过检测exo-miRNA丰度帮助评估疾病严重程度。
KD是一种以婴幼儿发病为主的急性自限性血管炎，目前发病机制尚不清晰，因其特殊的临床表现又称为黏膜皮肤淋巴结综合征。据临床数据统计，KD患儿若不接受任何形式的治疗，其冠状动脉瘤(CAA)发生率高达25%，也是儿童后天性心脏病的主要病因之一[22]。KD的并发症中，最为严重的是冠状动脉损害，如CAA、血管腔狭窄、血栓形成，严重的甚至会导致猝死，因此如何在疾病早期找到特异生物标志物尤为重要。
Jia等[23]研究证明，血清exo-miRNA中，miR-1246/miR-4436b-5p不仅在KD患儿中显著上调，且免疫球蛋白(IVIG)治疗前后患儿血清中含量也有差异，这证明miRNA不仅可作为KD特异性诊断标志物参与早期诊断，还可参与IVIG疗效评估。Zhang等[24]研究证明，在KD患儿血清exo-miRNA中，miR-328上调，而miR-575、miR-134和miR-671-5p下调；在IVIG治疗后，该趋势则完全反转，这证明上述4种血清exo-miRNA也可用作早期诊断KD、评价IVIG疗效的特异性生物标志物。Wang等[25]通过对比KD组与正常组血清exo-miRNA水平发现，miR-let-7i-3p可作为KD诱导CAA患儿的特异性生物标志物，提高早期诊断的准确性。
儿童感染性心肌炎是指心肌局灶性、弥漫性炎症病变，病理方面主要表现为间质炎症细胞浸润、心肌变性、坏死等，通常以病毒感染最为常见。儿童病毒性心肌炎(VM)是由病毒直接侵犯心肌细胞和自身免疫性心肌损害引起的相关疾病，重者可导致心源性猝死、充血性HF、心率失常等一系列疾病。
Li等[26]研究表明，心脏祖细胞来源的外泌体(CPCs-Ex)可通过降低大鼠心肌母细胞(H9C2)的凋亡和柯萨奇B3(CVB3) mRNA的表达参与调控凋亡因子的表达。CPCs-Ex可通过抑制CVB3的增殖、调节哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路及调控B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)和含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(caspase)家族，起抗细胞凋亡、治疗VM的作用(图1)。Fan等[27]通过小鼠实验证明，直接靶点为细胞信号转导抑制因子3(SOCS3)的exo-miR-181d、exo-miR-30a可能与CVB3诱导的VM发病机制相关，且这2种miRNA还具有作为VM诊断生物标志物的潜力。
注：Bcl-2：B淋巴细胞瘤-2；CVB3：柯萨奇病毒B3；CPCs-Ex：心脏祖细胞来源外泌体；Bim：Bcl-2蛋白相互作用的细胞凋亡调节子；Bax：Bcl-2蛋白相关X蛋白；Caspase：含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶；H9C2：大鼠心肌母细胞 Bcl-2：B-cell lymphoma-2；CVB3：coxsackie virus B3；CPCs-Ex：cardiac progenitor cell-derived exosomes；Bim：Bcl-2 protein-interacting apoptosis regulon；Bax：Bcl-2 protein-associated X protein；Caspase：cysteine-containing aspartic acid proteolytic enzyme；H9C2：rat cardiomyoblast
儿童心肌病是儿童时期的急重症，预后差，常伴严重程度不一的心肌损害和心肌功能不全等后遗症。儿童心肌病主要分为以扩张型心肌病(DCM)、糖尿病性心肌病为主的遗传性心肌病、以肥厚型心肌病(HCM)为主的混合性心肌病和后天获得性心肌病。其中，心肌纤维化和心肌重塑是心肌病最主要的病理生理表现，最终会逐渐发展为微循环、心肌的缺氧缺血。
Huang等[28]研究发现，心脏成纤维细胞可分泌富含星形miRNA的外泌体，且miR-21具有强效的旁分泌作用；该课题组通过建立AngⅡ诱发心肌肥大的小鼠模型，发现心脏成纤维细胞exo-miR-21可靶向沉默心肌细胞中的SORBS2与PDLIM5导致心肌肥大。因此，exo-miR-21可作为心肌肥大的旁分泌信号介质，具有靶向治疗特定位点的潜力。
在儿童中，肥胖会增加代谢疾病及心血管功能紊乱的风险，同时，在发育过程中更易发生左心室肥大，这直接导致他们患DCM的风险较一般儿童高。Wang等[29]研究发现，循环中exo-miR-122水平与介导心脏功能障碍的参数直接相关，包括射血分数(EF)降低和N末端B型利钠肽原(NT-proBNP)升高；在肥胖小鼠模型中，肝脏和循环中exo-miR-122含量增加会参与破坏心脏结构和EF，该miRNA升高还会直接抑制细胞线粒体活性。综上，exo-miR-122可通过抑制线粒体ADP-Arl-2建立miR-122/线粒体Arl-2信号传导通路来影响心肌功能。
Nie等[30]和Li等[31]分别通过测试不同身材人群循环exo-miR-194与exo-miR-29a水平得出，这2种miRNA会损害心肌细胞的线粒体活性而影响人类心肌功能来增加心肌病发病率；该课题组后续实验还证明，exo-miR-194 sponge与exo-miR-29a sponge可有效改善心肌功能[30]，说明这2种miRNA sponge有望成为一种治疗手段应用于肥胖儿童心肌病领域。
儿童期糖尿病是发生糖尿病性心肌病的重要原因之一，也是导致青少年HF的重要因素。Wang等[32]报道，心肌细胞来源的外泌体可转移miR-320进入动脉内皮细胞，在2型糖尿病大鼠中发挥抗血管生成的作用，这说明心肌细胞来源的外泌体可抑制动脉内皮细胞增殖、阻碍新生血管生成，进而增加HF的可能性；该课题组还证实，健康心肌细胞来源的exo-miR-320可功能性下调受体细胞内的靶基因，靶向调节热休克蛋白Hsp20。
AMI是冠状动脉粥样斑块发生破裂而引起的冠状动脉血流急剧减少、心肌细胞持续缺氧缺血、灌注不足而导致的心肌坏死。发生于儿童的心肌梗死常伴发于儿童冠脉粥样硬化、冠状动脉栓塞、先天性冠状动脉畸形及KD后冠状动脉损伤等，通常起病急，病死率极高。因此，如何在早期识别并诊断AMI，及时给予干预措施，是目前临床研究的重点。
Davidson和Yellon[33]证明，外泌体在心脏急性缺血、再灌注模型及慢性心肌缺血中均可起保护心脏的作用。除了在病情初期减少心脏梗死面积外，外泌体还可刺激血管生成、减少心肌纤维化、增强免疫细胞功能并长期改善心脏收缩能力。Bellin等[34]通过建立大鼠模型证实，在CPLs-Ex的条件培养基中，可有效减少小鼠心房肌细胞HL-1的凋亡，且可促进人脐静脉内皮细胞增生，同时发现在CPLs-Ex中高度富集了exo-miR210和exo-miR132。这充分说明CPLs-Ex的miRNA可能同时具有心脏保护和促进血管新生的作用。
外泌体可作为小鼠骨髓CD34+干细胞的活性成分帮助促进新生血管形成、促进猪和小鼠心肌梗死时胚胎间充质干细胞(MSC)的再生等，且此类exo-miRNA也具有促进血管新生、减缓心肌细胞凋亡的作用[35]。
凋亡和自噬是2种心脏病基因调控层面的细胞死亡[36]，也是细胞的一种自我更新和自我保护的调控机制，也是维护细胞稳态的基本。Youn等[37]发现，从健康心脏细胞中分泌的exo-miR-21-5p可作用于心肌细胞，参与调控细胞凋亡、微循环血管生成并有效改善小鼠心肌梗死模型的心脏功能，这说明exo-miRNA可参与心肌代偿保护机制。Yang等[38]通过定量检测AMI患者血清外泌体miRNA证明，miR-30a在AMI患者的血清和心肌细胞培养基中高度富集，证实缺氧心肌细胞来源的外泌体可通过旁分泌方式转移miR-30a来限制机体内自噬活动，阻止细胞程序性死亡。
Li等[39]研究证实，源自MSC的exo-miR-301可有效减少大鼠心肌梗死面积，且携带过表达miR-301的外泌体可显著改善心肌梗死大鼠的心肌射血功能。Zhao等[40]研究表明，MSC来源的exo-miR-182可通过调节机体巨噬细胞极化帮助减轻心肌梗死时的缺血再灌注损伤。上述2个研究表明，MSC来源的exo-miR-182和exo-miR-301不仅有希望作为潜在的治疗手段应用于心肌梗死领域，还可参与治疗后的疗效评估。类似地，Gu等[41]研究发现，血清源性外泌体可通过调节exo-miR-21/PDCD4信号通路，显著降低AMI模型的心肌损伤并减少AMI后小鼠心脏梗死面积，为AMI治疗提供新的策略。
通常，AMI导致HF的主要原因为心肌细胞再生障碍，因此，如何在梗死发生后及时促进心肌细胞增殖是帮助重建心脏功能的关键。Wang等[42]利用基因转染技术在MSC表面表达心肌肌钙蛋白I(cTnI)靶向短肽，并将cTnI靶向外泌体定位到病变心肌，帮助促进心肌细胞再生，故Has-miR-590-3p可成为一种新兴的治疗手段运用于AMI中(图2)。
儿童先天性心脏病(CHD)是由于发育过程中心脏及血管出现发育迟缓或障碍，导致心血管系统功能、代谢、解剖结构等发生异常。据统计，CHD患儿约占新生儿的0.4%~1.0%，且是婴儿死亡的主要原因[43]。Shi等[44]报道，糖尿病孕鼠的血液exo-miRNA含量较正常孕鼠有明显差异，且多个RNA参与胎儿心脏发育调节；同时还发现，外泌体可跨越胎盘屏障浸润胎儿心脏和胚胎组织器官。该研究表明，通过检测特定exo-miRNA浓度可为评估胎儿CHD风险及可作为潜在治疗手段运用到CHD患儿中。
儿童心房颤动(AF)是室上性心律失常中最严重的类型，易激发严重的血流动力学改变，严重者甚至导致死亡，是儿科心血管疾病中的急重症。Wang等[45]报道，exo-miR-483-5p、miR-142-5p、miR-223-3p在AF患者血浆中显著上调，证明这3种miRNA可作为特异性生物标志物帮助早期评估AF严重性及预后。
目前，大部分儿童心血管系统疾病发病机制和诱因仍未明确。exo-miRNA作为一种新兴的小RNA分子，参与体内多种细胞增殖、分化、凋亡等生物学活动，现已成为研究热点(表1)。生物标志物是日常临床实践中早期诊断、风险预测、预后评估的重要工具，而外泌体特殊的外膜结构保护外泌体内容物免受水解酶水解、有效降低机体生物毒性和免疫原性、可在体液中稳定存在、保持稳定的丰度，这些优点无疑为其成为疾病特异性生物标志物、协助诊断及治疗临床疾病、帮助评估疾病风险等增加了说服力。
参与诊断或治疗儿童心血管疾病的潜在外泌体源性微小RNA生物标志物
Potential exosome-derived microRNA biomarkers involved in the diagnosis or treatment of cardiovascular diseases in children
参与诊断或治疗儿童心血管疾病的潜在外泌体源性微小RNA生物标志物
Potential exosome-derived microRNA biomarkers involved in the diagnosis or treatment of cardiovascular diseases in children
| 疾病 | miRNA ID | 样本来源 | 样本 | 功能 |
|---|---|---|---|---|
| 急性心肌梗死 | miR-30a | 血清 | 血清 | 缺氧心肌细胞的外泌体通过旁分泌方式转移miR-30a调节自噬[38] |
| 急性心肌梗死 | miR-301 | 间充质干细胞 | 间充质干细胞 | 通过抑制心肌自噬保护梗死心肌[39] |
| 急性心肌梗死 | miR-182 | 间充质干细胞 | 间充质干细胞 | 通过调节巨噬细胞的极化减轻心肌梗死后的缺血再灌注损伤[39,40] |
| 急性心肌梗死 | miR-182 | 间充质干细胞 | 间充质干细胞 | 心肌细胞内吞作用促进梗死周围区心肌细胞增殖，恢复心功能[39,40] |
| 急性心肌梗死 | miR-21 | 血清 | 心肌细胞 | 减少急性心肌梗死细胞和小鼠模型的心肌细胞凋亡，减少急性心肌梗死后小鼠心脏的梗死面积[41] |
| 心力衰竭 | miR-222 | 血清 | 循环细胞 | 抵抗缺血性损伤后的不良心脏重塑和功能障碍[16] |
| 心力衰竭 | miR425、miR-744 | 全血血浆 | 全血血浆 | 预测心脏纤维化和心力衰竭的生物标志物，减缓心脏纤维化的进展或预测心脏纤维化和心力衰竭，减缓心脏纤维化的进展[18] |
| 心力衰竭 | miR-92b-5p | 血清 | 循环细胞 | 扩张性心肌病导致急性心力衰竭和射血分数降低的生物标志物[19] |
| 心力衰竭 | miR-194、miR-34a、miR192 | 血清 | 心肌细胞 | 缺血性心力衰竭的预测因子；连接p53通路，作为心力衰竭循环调节因子参与调节心室舒张能力[20] |
| 心力衰竭 | miR-660-3p、miR-665、miR-1285-3p | 全血血浆 | 全血血浆 | 慢性心力衰竭的生物标志物；评估疾病的严重程度[21] |
| 川崎病 | miR-1246、miR-4436b-5p | 血清 | 血清 | 川崎病的生物标志物；评价免疫球蛋白的疗效[23] |
| 川崎病 | miR-328、miR-575、miR-134、miR-671-5p | 血清 | 血清 | 川崎病的生物标志物；评价免疫球蛋白的疗效[24] |
| 川崎病 | let-7i-3p | 血清 | 血清 | 川崎病继发冠状动脉损伤的生物标志物[25] |
| 病毒性心肌炎 | CPCs-Ex | 心脏祖细胞 | 心脏祖细胞 | 减少大鼠心肌母细胞凋亡和柯萨奇病毒B3型mRNA表达，参与调节凋亡因子的表达[26] |
| 病毒性心肌炎 | miR-30a、miR-181d | 血清 | 循环细胞 | 病毒性心肌炎的生物标志物[27] |
| 心肌病 | miR-21 | 心纤维瘤 | 心纤维瘤细胞 | 作为心肌肥大的旁分泌信号传导介质；可能靶向特定位点[28] |
| 心肌病 | miR-122 | 血清 | 肝脏及循环细胞 | 反映心脏结构和射血功能；直接抑制线粒体活性[29] |
| 心肌病 | miR-194、miR-29a | 血清 | 循环细胞 | 损伤心肌细胞线粒体活性，影响人体心肌功能[30,31] |
| 糖尿病性心肌病 | miR-320 | 心肌细胞 | 心肌细胞 | 受体细胞靶基因的功能下调，靶向热休克蛋白Hsp20功能[32] |
| 心房颤动 | miR-483-5p、miR-142-5p、miR-223-3p | 全血血浆 | 循环细胞 | 帮助早期评估心房颤动严重程度和预后的生物标志物[45] |
注：CPCs-Ex：心脏祖细胞来源的外泌体 CPCs-Ex：cardiac progenitor cells-exosomes
尽管如此，对于exo-miRNA的研究仍有许多问题亟需解决：(1)由于外泌体本身体积较小且分离出的浓度有限，如何提升鉴定物理表征和定量的相关技术；(2)能否找到更快速、灵敏、具有成本效益的金标准方法来分离出纯净、高浓度的exo-miRNA；(3)如何找到与心血管细胞直接相关的细胞外泌体miRNA，从而找到更可靠、更有说服力的证据证实其与疾病的直接相关性；(4)由于外泌体可渗透细胞膜、穿过血脑屏障以及其优异的生物分布、相容性和特有的细胞间通讯功能，使用其作为载体帮助靶向运输药物的可能性已大大提升，但以上种种猜想，都需更多的研究来证实和补充。不过，未来通过对exo-miRNA更深入的了解和研究，相信能为儿童心血管疾病提供新的诊疗思路，为患儿疾病进程评估、治疗后效果评估提供更多有力证明。
所有作者均声明不存在利益冲突
