干细胞是一类具有自我更新能力和多向分化潜能的细胞，在组织器官再生修复等方面发挥着极其重要的作用^［1］。干细胞治疗已成为当今再生医学研究最前沿的技术之一，在各国都掀起了研究与应用的热潮，开展了一系列临床试验，并取得了显著的疗效。我国已将干细胞治疗纳入《“十四五”生物经济发展规划》^［2］，并将干细胞的临床研究应用列为国家重点发展的产业，同时要求对开展临床应用的干细胞治疗等新技术制定并完善技术规范。目前针对人胚干细胞、人诱导多能干细胞、人间充质干细胞的团体标准已相继出台，为其相关临床转化应用建立了质量控制参考依据。

小细胞外囊泡（small extracellular vesicles，sEVs）是由细胞主动分泌的具有脂质双分子层膜结构的直径＜200 nm的微小囊泡，可选择性地包裹来源细胞的蛋白质、脂质、核酸、代谢物质等各类分子，是细胞间信息交流的重要介质，调控人体多种生理和病理过程^［3］。人干细胞来源的sEVs作为一种“无细胞的干细胞治疗技术”，已在多种疾病的临床前研究中展现出显著的治疗效果^［4］，包括心血管疾病、神经性退行性疾病、糖尿病、骨关节疾病、风湿及类风湿、异常免疫疾病等。人干细胞来源的sEVs在发挥干细胞功能的同时，还具有使用灵活、免疫原性低、易于储存和运输等优势。因此，其已成为引领干细胞治疗研究和应用的新方向。世界各国竞相开展人干细胞来源的sEVs的临床试验，目前在clinicaltrials.gov记录的项目已达数十项，其中近10项由中国的医学院或医院组织开展^［5］，包括中山大学眼科中心、瑞金医院等单位，主要治疗干眼症^［6］、阿尔茨海默症^［7］等疾病。针对时下危害全球人类健康的新型冠状病毒肺炎，也已开展多项人干细胞来源的sEVs的临床试验，并取得了初步成效^{［8, 9］}。尽管大量临床试验正在如火如荼的开展，然而干细胞来源的sEVs物理与生物化学特性的表征与质量控制方法尚缺乏统一标准。如何稳定、可重复且规模化地生产符合良好生产规范（good manufacture practice，GMP）的人干细胞来源sEVs，是进行临床应用前必须解决的关键问题。为了推进人干细胞来源sEVs在疾病治疗领域的应用，迫切需要建立人干细胞来源sEVs的质量标准体系。

为响应“十四五”规划中提出加快发展生物医药等产业，做大做强生物经济的指导思想^［2］，中国研究型医院学会细胞外囊泡研究与应用专业委员会（Chinese Society for Extracellular Vesicles，CSEV）针对目前研究最多的2类干细胞来源的sEVs，于2021年12月28日首次发布了《人多能干细胞来源的小细胞外囊泡》^［10］及《人间充质干细胞来源的小细胞外囊泡》^［11］两项团体标准，并于2022年1月1日开始实施。这2项团体标准参考了团体标准T/CSCB 0002《人胚干细胞》^［12］、T/CSCB 0005《人诱导多能干细胞》^［13］、T/CSCB 0003《人间充质干细胞》^［14］以及T/CSCB 0001《干细胞通用要求》^［15］，结合国内外相关学者的研究结果^［3，16］，分别制定并形成了人多能干细胞与人间充质干细胞来源的sEVs的技术要求、检测方法、检验规则、使用说明、标签、包装、储存、运输和废弃物处理要求，适用于人多能干细胞与人间充质干细胞来源的sEVs的生产与检测。这2项标准的制定旨在为人干细胞来源sEVs研究与应用提供参考，促进国内人干细胞来源sEVs的产学研结合，理性引导技术转化，并服务于民生。下面对这2项团体标准的重点条款进行解读，以便于相关研究人员更好的理解和应用该标准。

这2项团体标准分别针对人多能干细胞和人间充质干细胞来源的sEVs而制定。

1.人多能干细胞：是指具有在体外无限地自我更新和向三胚层细胞分化潜能的干细胞，包括人胚干细胞和人诱导多能干细胞。其中人胚干细胞是指源自胚胎着床前胚胎中未分化的初始细胞；人诱导多能干细胞是指由人体细胞经重编程而获得的一种多能干细胞。用于生产sEVs的人多能干细胞的关键质量属性需分别完全符合团体标准T/CSCB 0002《人胚干细胞》^［12］和T/CSCB 0005《人诱导多能干细胞》^［13］的规定。

2.人间充质干细胞：是指可在体外自我更新并具有成骨、成脂、成软骨等分化能力的成纤维细胞样（纺锤形和梭形）的干细胞。人间充质干细胞可由多种人体组织（如骨髓、脐带、胎盘、脂肪、脐带血等）分离得到，也可以通过分化或转分化等方式获得。不同来源的人间充质干细胞在基因表达和分化能力方面存在差异。用于生产sEVs的人间充质干细胞的关键质量属性均完全符合团体标准T/CSCB 0003《人间充质干细胞》^［14］的规定。

sEVs分离纯化自人干细胞培养上清液。因此，干细胞的培养体系是生产sEVs重要的一环。其培养体系包括培养液、基质胶以及消化酶等均应采用成分明确的GMP级制剂，收获的干细胞培养上清液中不应引入其他来源的囊泡，以免影响最终收获的sEVs。

1.形态：sEVs的形态采用透射电镜的方法进行观察，获得的图像应为不聚团的具有清晰膜结构的茶托状或杯状结构，边缘清晰，在透射电镜下对单个sEVs进行测量时，其直径应＜200 nm^［3］。

2.粒径：sEVs的颗粒直径分布应用纳米流式细胞仪进行检测，这种方法可以获得sEVs样本群体中单个sEVs的颗粒直径，群体的颗粒直径分布数据应在＜200 nm的范围内，且在范围内存在粒径峰值^［3］。

3.标志蛋白：sEVs的膜表面或膜内携带了包括CD9、CD63、CD81、溶酶体关联膜蛋白（lysosome- associated membrane glycoprotein 1/2，LAMP1/2）、肿瘤易感基因101（tumor susceptibility gene 101，TSG-101）、Alix、热激蛋白（HSP70）等多种蛋白^［3］。当同时鉴定到sEVs膜表面和膜内的标志蛋白时，可以从一个方面确认sEVs的存在。本标准选取研究中最常用的膜表面标志蛋白（CD9、CD81、CD63中的任意2个）与内部标志蛋白（TSG-101、Alix中的任意一个）表达阳性来鉴定sEVs。对于干细胞来源的sEVs的标志蛋白，蛋白印迹法是目前最通用的检测方法^［3］。

4.纯度：纯度是sEVs质量控制的重要指标，干细胞来源的sEVs分离自干细胞的培养上清液，制备过程中可能被培养上清中的蛋白成分或细胞器来源的蛋白等污染。根据国内外学者研究结果，本标准规定了2种方式鉴定sEVs的纯度，包括sEVs阴性标志物检测与sEVs数量与蛋白量比值测定。当2种方法的结果同时达标时，可认定该sEVs制剂纯度合格。（1）sEVs阴性标志物检测：sEVs在生物发生上距离细胞核、线粒体、高尔基体、内质网等细胞器较远，基本不表达这些细胞器的特异蛋白^［3］。因此，这些细胞器的特异性蛋白的出现可作为sEVs制剂不纯的证据。高尔基体来源GM130及内质网来源蛋白Calnexin等蛋白常作为sEVs检测的阴性标志物^［3］，本标准中规定GM130或Calnexin的蛋白印迹法检测结果应为阴性；（2）sEVs数量与蛋白量比值：有研究结果显示，在相同的蛋白浓度下，sEVs数量越高，则制剂的纯度越高^［17］。根据经验总结该比值≥1×10⁸个颗粒/µg蛋白时可认为是纯度较高的sEVs。其中计算该数值的sEVs颗粒数用纳米流式细胞仪测定，蛋白量用BCA试剂盒测定。

5.生物活性：用于后续研究或临床试验的sEVs应具有生物活性。因此，根据2种sEVs的特性，2项标准分别规定了针对人多能干细胞来源的sEVs与人间充质干细胞来源的sEVs的生物活性检测方法。（1）人多能干细胞来源的sEVs：人多能干细胞来源的sEVs具有强大的促进血管新生、组织再生修复的作用；因此，选用CCK8实验检测其对内皮细胞与成纤维细胞的促增殖作用。（2）人间充质干细胞来源的sEVs：有研究结果表明，人间充质干细胞来源的sEVs具有与间充质干细胞类似的免疫调节作用^{［18, 19］}，可以抑制淋巴细胞增殖及Th1细胞反应。因此，标准中选取淋巴细胞增殖实验和Th1细胞功能实验评价其生物活性。

6.微生物：微生物会导致sEVs的失效或对患者造成不良反应。sEVs的生产、包装均应对常见的微生物进行检测，包括人类免疫缺陷病毒（HIV）、乙肝病毒（HBV）、丙型肝炎病毒（HCV）、人类嗜T淋巴细胞病毒（HTLV）、人巨细胞病毒（HCMV）、真菌、细菌、支原体等，应严格满足相应要求。

sEVs作为纳米级囊泡，易于吸附在常规容器的内壁。为减少吸附所带来的样本损失，sEVs制剂应采用低吸附的、对sEVs关键质量属性无影响的材料和容器保存。sEVs携带的蛋白和核酸等活性物质在高温时容易发生降解。因此，sEVs制剂应在-80 ℃冰箱或液氮中储存，避免反复冻融或温度剧烈波动。冻存的sEVs需用干冰或液氮下运输，非冻存的sEVs应在2～8 ℃条件下运输。

以上是针对团体标准《人多能干细胞来源的小细胞外囊泡》及《人间充质干细胞来源的小细胞外囊泡》重点条款的解读。目前已报道有多种方法可用于分离sEVs^［20］，在此对分离方法及相关生产设施不做具体规定。不同方法所得sEVs能达到团体标准规定的关键质量属性要求即可；但应记录相关分离方法，生产环境应达到GMP级。此外，这2种sEVs分别来源于人多能干细胞与间充质干细胞。2种干细胞的性质与功能不同，细胞关键质量属性应分别参照上述的相应团体标准。2种sEVs的关键质量属性中形态、粒径、标志蛋白、纯度以及微生物检测在2项团体标准中规定一致，而生物活性则依据其功能差异检测方法不同。

这2项标准分别是我国首部针对人多能干细胞或人间充质干细胞来源sEVs的团体标准。其发布有助于形成行业基本共识，推动国家标准乃至国际标准的制定，进一步规范人多能干细胞和人间充质干细胞来源sEVs的研究和临床应用，切实推动我国以干细胞治疗为代表的再生医学的健康快速发展。随着研究的不断深入，干细胞来源的sEVs作为再生医学领域的“新星”必将更为广泛地应用于临床。为了满足干细胞来源sEVs临床应用的需要，要逐步实现其GMP级生产，包括建立干细胞的大规模自动化培养以及sEVs的自动化的收集、提取和纯化等技术，对其关键质量属性的标准也需要不断的完善。同时针对不同疾病，要逐渐建立相应的方法对干细胞来源sEVs的生物活性进行检测和判断。未来干细胞来源sEVs的不断应用实践以及相关政策及标准的发布将为该标准的修订与完善提供重要参考及依据，以期更好的规范sEVs的研究与应用，促进干细胞再生医学行业的蓬勃发展，造福于人类。