探讨RNA恒温扩增技术(RNA－simultaneous amplification and testing，RNA－SAT)诊断新生儿解脲脲原体(Ureaplasma urealyticum，Uu)的价值。
选取2014年3月至2016年3月本院新生儿科收治的疑似Uu感染患儿，取咽拭子或气管内分泌物标本，分别采用分离培养法、RNA－SAT法、荧光定量聚合酶链反应(fluorescence quantitative polymerase chain reaction，FQ－PCR)法及胶体金法检测Uu，以分离培养法阳性作为参考，计算另外3种检测方法的敏感度、特异度、阳性预测值和阴性预测值，以及治疗后的阴转率。
共纳入210例临床疑似Uu感染新生儿，治疗前分离培养法Uu阳性56例，以此为参考，RNA－SAT法、FQ－PCR法和胶体金法检测Uu的敏感度和特异度分别为91.1%和95.5%、89.3%和90.9%、75.0%和94.2%，RNA－SAT法敏感度和特异度均最高。治疗7、14、21 d RNA－SAT法检测Uu的阴转率分别为48.9%(23/47)、72.3%(34/47)、93.6%(44/47)，治疗21 d时RNA－SAT法阴转率高于FQ－PCR法和胶体金法，差异有统计学意义(P<0.05)。
RNA－SAT法检测新生儿Uu感染的敏感度和特异度均较高，对新生儿Uu感染疗效的评价有应用价值。
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解脲脲原体(Ureaplasma urealyticum，Uu)是一类条件致病菌，常寄生于阴道和宫颈。研究报道Uu可刺激炎症介质释放，诱发宫内炎症反应，从而引起自发性流产、胎膜早破、早产等不良妊娠结局[1,2,3]，还可引起新生儿肺炎、败血症、脑膜炎等[4]。目前尚无特别推荐用于诊断Uu的方法。Uu对生存环境敏感，极易死亡，新生儿早期一次性咽部分泌物或气管内吸出物样本Uu检出率并不高[5]。因此选择一种较理想的检测方法对于新生儿Uu感染的诊治及预后有重要临床意义。本研究应用RNA恒温扩增技术(RNA－simultaneous amplification and testing，RNA－SAT)、荧光定量聚合酶链反应(fluorescence quantitative polymerase chain reaction，FQ－PCR)及胶体金法检测210例新生儿咽拭子标本Uu，探讨不同方法的应用价值，以期为临床提供快速特异的病原学诊断方法。
选取2014年3月至2016年3月本院新生儿科收治的疑似Uu感染患儿为研究对象。入选标准：①出生3 h内入院；②出生后2周内出现呼吸困难，有呻吟、气促、肺部啰音等临床表现和体征；③母亲阴道分泌物Uu阳性，或有胎膜早破或绒毛膜羊膜炎。排除标准：①先天畸形、染色体病、遗传代谢性疾病；②明确为非Uu感染的其他细菌或病毒感染。
本研究为前瞻性研究，经医院伦理委员会批准，患儿家属均知情同意，检测费用来自温州市重点学科(新生儿疾病筛查)经费。
治疗前取新生儿咽拭子或气管内分泌物标本置于无菌采样管中，一式三份。一份样本加入适量样本稀释液，在胶体金试剂板加样孔内滴入2～3滴裂解溶液，用于胶体金法检测；一份加入2 ml生理盐水充分洗脱，吸取1 ml至有样本保存液(防止RNA降解)的标本管中混匀，RNA－SAT上机扩增，剩余1 ml用于FQ－PCR扩增；另一份接种于液体培养基后，用于分离培养。治疗7、14、21 d后重新取样检测。
取5 μl标本RNA加至含35 μl扩增检测液微量管中，置于恒温金属浴内：60 ℃ 10 min，42 ℃ 5 min，加入42 ℃预热SAT酶；应用ABI 7500 FQ－PCR仪扩增42 ℃ 1 min，40个循环，每循环采1次荧光，选取FAM通道。样本曲线与阈值线交点的横坐标读数ct值<38判读为阳性，ct值≥38或无数值判读为阴性。RNA－SAT检测试剂盒和PCR扩增仪分别购自上海仁度生物科技有限公司及美国ABI公司。
1ml分泌物标本用生理盐水洗脱后置1.5 ml EP管，13 000 r/min离心5 min，取沉淀物加入50 μl细胞裂解液，100 ℃煮沸10 min。13 000 r/min离心5 min，取2.5 μl上清液置入已配好的FQ－PCR反应液，应用ABI 7500 FQ－PCR仪扩增95 ℃ 5 min，95 ℃ 30 s，58 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，35个循环；72 ℃10 min。FQ－PCR相关试剂购自中山达安基因股份有限公司。
将样本裂解获得Uu抗原，在胶体金试剂板加样孔内滴入适量裂解溶液，10～15 min后读取结果。测试区和质控区内均有紫红色带出现，表明样品中含有Uu抗原；仅质控区出现一条紫红色带或质控区未出现紫红色带表明结果为阴性或测试无效。相关试剂盒购自杭州艾康生物技术有限公司。
将样本接种于液体培养基后置于37 ℃孵箱，分别于24、48 h后观察Uu的颜色变化。48 h内培养基如由黄变红，立即再次过滤，取0.2 ml转种于Uu选择性培养基。后置37 ℃、CO2孵育箱中孵育，48 h后观察菌落。在相差显微镜下观察到15～50 μm棕色特征性的细小"荷包蛋"样菌落或颗粒样、桑椹样菌落即为Uu阳性。相关试剂盒购自珠海丽珠试剂股份有限公司。
Uu阳性且呼吸困难、X线提示肺炎的患儿口服阿奇霉素10 mg/(kg·d)治疗1周后改为5 mg/(kg·d)1～2周，无临床症状者予以观察[6]。
应用SPSS 21.0统计软件对数据进行分析。计数资料以例(%)表示，组间比较采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。
研究期间共纳入临床疑似Uu感染新生儿210例，其中男117例，女93例；早产儿135例，胎龄29～36周，出生体重(1 710±200)g；足月儿75例，胎龄37～42周，出生体重(2 850±200)g；治疗前分离培养法阳性56例。
以分离培养法阳性为参考，RNA－SAT法的敏感度、特异度、阳性预测值和阴性预测值均高于FQ－PCR法和胶体金法，FQ－PCR法敏感度和阴性预测值高于胶体金法，特异度和阳性预测值低于胶体金法。见表1。
不同方法检测新生儿解脲脲原体感染价值比较(n＝210)
不同方法检测新生儿解脲脲原体感染价值比较(n＝210)
| 检测方法 | 分离培养法(例) | 敏感度(%) | 特异度(%) | 阳性预测值(%) | 阴性预测值(%) | ||
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 阳性 | 阴性 | ||||||
| RNA－SAT法 | 阳性 | 51 | 7 | 91.1 | 95.5 | 87.9 | 96.7 |
| 阴性 | 5 | 147 | |||||
| FQ－PCR法 | 阳性 | 50 | 14 | 89.3 | 90.9 | 78.1 | 95.9 |
| 阴性 | 6 | 140 | |||||
| 胶体金法 | 阳性 | 42 | 9 | 75.0 | 94.2 | 82.4 | 91.2 |
| 阴性 | 14 | 145 | |||||
注：RNA－SAT为RNA恒温扩增技术，FQ－PCR为荧光定量聚合酶链反应
分离培养法Uu阳性、临床资料完善且住院>28 d的新生儿共47例，阿奇霉素10mg/(kg·d)治疗1周后，Uu未阴转的患儿继续5 mg/(kg·d)治疗1～2周。治疗7 d和14 d时3种方法检测Uu的阴转率差异无统计学意义(P>0.05)，治疗21 d时RNA－SAT法阴转率高于FQ－PCR法和胶体金法，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。
不同方法检测解脲脲原体阴转率比较(n＝47)
不同方法检测解脲脲原体阴转率比较(n＝47)
| 检测方法 | 治疗7 d | 治疗14 d | 治疗21 d | |||
|---|---|---|---|---|---|---|
| 阳性 | 阴转率(%) | 阳性 | 阴转率(%) | 阳性 | 阴转率(%) | |
| RNA－SAT法 | 24 | 48.9 | 13 | 72.3 | 3 | 93.6 |
| FQ－PCR法 | 28 | 40.4 | 20 | 57.4 | 11 | 76.6 |
| 胶体金法 | 31 | 34.0 | 19 | 59.6 | 12 | 74.5 |
注：RNA－SAT为RNA恒温扩增技术，FQ－PCR为荧光定量聚合酶链反应
RNA－SAT法是近年开展的一种新型核酸扩增技术，其检测结果可作为区分死菌、活菌的依据，更利于用药后疗效监测，判断是否治愈，非常适合用于病原体筛查、疾病辅助诊断[9]。Uu主要引起泌尿生殖道感染和新生儿疾病[10]。近年来，有关Uu检测的准确性、评估病程进展程度、判断预后等问题越来越引起大家的关注。选择一种较理想的检测方法对于Uu感染的诊治及预后有重要临床意义。
本研究以分离培养法为参考，应用RNA－SAT法、FQ－PCR法及胶体金法对210例临床疑似Uu感染新生儿分泌物或气管内吸出物进行Uu检测，结果显示RNA－SAT法的敏感度和特异度均高于其他两种方法，与相关文献报道基本一致[11]，在一定程度上弥补了新生儿标本取样病原菌DNA含量偏低造成的假阴性情况。RNA－SAT检测的是病原体RNA，RNA在普通环境中极易降解，但RNA－SAT阳性预测值和阴性预测值均高于FQ－PCR法和胶体金法，可能原因为RNA－SAT技术依赖于RNA的扩增，而活的病原微生物才能转录RNA，FQ－PCR和胶体金法不能区分死菌。
本组Uu感染新生儿中，47例口服阿奇霉素治疗后7、14、21 d应用3种检测方法复查，结果显示RNA－SAT法阴转率高于FQ－PCR及胶体金法，这与RNA－SAT法活菌扩增、死菌不扩增的特点相符[12]，有效避免了因死菌、杂菌等原因造成假阳性导致的过度治疗。根据敏感度、特异度等指标综合判断，RNA－SAT法和FQ－PCR法对初诊、未治疗的患儿进行Uu检测作用相当，均可作为判断病原体感染的指标。但从阴转率分析，FQ－PCR法和胶体金法因不能区别活菌和死菌，因此不适合作为判断治愈的标准。RNA－SAT法由于RNA在死亡的病原体中快速降解并能排除死菌残留DNA对检测结果的影响，有利于临床治疗后的疗效观察。
综上所述，RNA－SAT法检测新生儿Uu感染敏感度高、特异度高，提高了新生儿咽拭子或气管内分泌物标本的Uu感染检出率，而且RNA在环境中极不稳定、易降解，降低了交叉污染引起假阳性的问题，能更好地判断疗效，适合临床对患儿进行快速特异的病原学诊断。
