探讨不同温度和容器保存对新鲜母乳成分的影响，寻找保存新鲜母乳的最佳方法。
收集2018年1～3月吉林省妇幼保健院60例产后30 d健康产妇的新鲜母乳各120 ml，每例产妇的母乳均等分为15份，1份为新鲜母乳，7份分装在聚乙烯储奶袋中，7份分装在聚乙烯储奶瓶中。储奶袋和储奶瓶中母乳分别保存于4℃(各3份)、－18℃(各2份)和－20℃(各2份)冰箱，4℃分别保存48、72、96 h，－18℃和－20℃分别保存30 d和90 d。检测新鲜母乳及不同保存方式母乳中细菌菌落总数、热卡、脂肪、蛋白质、乳糖、免疫活性因子(肿瘤坏死因子α、白细胞介素6、白细胞介素10、乳铁蛋白)含量等。
与新鲜母乳比较，(1)4℃保存48、72、96 h总菌落计数上升；－18℃和－20℃保存30、90 d菌落数下降，但差异均无统计学意义(P>0.05)。(2)4℃保存72、96 h脂肪下降，差异有统计学意义(P<0.05)，蛋白质、乳糖、热卡至96 h时差异仍无统计学意义(P>0.05)；－18℃和－20℃保存30 d脂肪、蛋白质、热卡均有所下降，90 d显著下降，差异有统计学意义(P<0.05)。(3)4℃保存72、96 h肿瘤坏死因子α下降，－18℃保存30、90 d上升，差异均有统计学意义(P<0.05); 4℃保存72、96 h, －18℃保存30、90 d白细胞介素6呈逐渐下降趋势，差异有统计学意义(P<0.05)；白细胞介素10含量呈上升趋势，但仅－18℃保存30、90 d差异有统计学意义(P<0.05)；－20℃和－18℃同期保存条件下肿瘤坏死因子α、白细胞介素6、白细胞介素10含量接近。与聚乙烯储奶袋储存母乳相比，聚乙烯储奶瓶储存母乳对母乳营养成分和免疫活性因子影响相对较小，但差异无统计学意义(P>0.05)。
低温保存母乳的不同时长对母乳主要营养素及一部分免疫活性因子具有一定影响。短时保存以冷藏为宜，时间不超过72 h，长期保存以－18℃冷冻为宜。聚乙烯储奶袋或储奶瓶储存母乳对母乳营养成分和免疫活性因子无明显影响。
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新鲜母乳含有多种营养物质，包括脂肪、优质蛋白质、乳糖以及免疫细胞和免疫活性因子[1]，还有一些利于新生儿肠道微生态形成的重要菌群，对新生儿肠道的免疫系统有启动、促进发育和成熟、识别有益微生物和有害病原体的作用[2]，是婴儿生长最理想的食品[3,4]。但很多危重新生儿或超低、极低出生体重儿不能及时喂养新鲜母乳，需将母乳暂时低温储存。目前国内外尚无公认、统一的新鲜母乳低温保存标准。英国母乳库协会推荐，新鲜母乳4℃条件下保存时间不应超过24 h，－20℃冷冻保存不超过3个月；2017修订版母乳喂养医学会推荐，新鲜母乳4℃最佳保存时间为3 d，－20℃可保存6个月；北美母乳库协会则推荐新鲜母乳4℃冷藏储存时间为8 d，－20℃冷冻储存12个月，－70℃深部冷冻可以保存更长时间[5,6]。有关母乳低温储存的研究表明，在低温过程中，母乳的部分营养成分和免疫、生物、杀菌活性均可能发生改变[7]。但目前我国相关研究很少，母乳样本保存温度、时间以及保存容器也各有不同，对母乳低温保存后的一些重要成分变化没有统一认识。本研究从细菌菌落数、宏量营养素及免疫活性因子等方面总体评价不同温度、不同时间、不同容器保存新鲜母乳对母乳营养成分、母乳微生物安全的影响，探讨最佳的母乳保存方式。
选择2018年1～3月本院产科分娩后30 d的产妇60例，收集新鲜母乳。入选标准：(1)分娩健康、足月新生儿；(2)年龄23～37岁；(3)身体健康，饮食结构良好，无特殊偏食；(4)生活以轻体力活动为主；(5)纯母乳喂养，乳量能满足婴儿生长发育。排除标准：(1)孕期或哺乳期吸烟、饮酒；(2)乳晕或乳头局部感染、乳腺炎症或全身活动性感染；(3)哺乳期需使用特殊药物治疗；(4)肥胖，妊娠前体质指数>28；(5)有产后抑郁或精神障碍表现；(6)滥用兴奋药物、毒品。本研究经吉林省妇幼保健院伦理委员会批准，哺乳期母亲均自愿参加并签署知情同意书。
产妇产后30 d门诊复查时，选择下午1～2点且情绪良好的状态下，由产科护士用吸奶器采集单侧或双侧乳房乳汁(>120 ml)。将新鲜母乳摇匀后取120 ml分为15份，每份8 ml，1份新鲜母乳立即检测，即保存条件为室温、0 h，其余分装于聚乙烯储奶袋和聚乙烯储奶瓶各7份，置于0～4℃冷藏箱中于1～2 h内送至实验室，分置于4℃冷藏各3份、－18℃冷冻各2份和－20℃冷冻各2份保存。
4℃冷藏母乳分别保存48、72、96 h，－18℃冷冻母乳和－20℃冷冻母乳均分别保存30、90 d。检测前室温复温，用KJ-202振荡器混匀后进行成分分析，样本处理及检测过程参考文献[3]。
(1)细菌总菌落计数：按照食品安全国家标准&食品微生物学检验菌落总数测定标准，应用稀释涂布平板法进行菌落计数。(2)宏量营养素检测：采用全自动母乳分析仪(MR-1011M)测定脂肪、蛋白质、乳糖和热卡，严格按照分析仪要求操作。(3)免疫活性因子测定：应用ELISA技术(酶标仪)检测母乳肿瘤坏死因子ɑ(tumor necrosis factors，TNF-α)、白细胞介素(interleuken，IL)6、IL-10、乳铁蛋白含量。
应用SPSS 20.0统计软件进行数据分析。正态分布的计量资料以
±s表示，采用单变量重复测量方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验。P<0.05为差异有统计学意义。
共入组60例乳母，年龄(28.5±2.3)岁(23～37岁)，产后30 d；初产妇51例，经产妇9例；顺产33例，剖宫产27例。新生儿胎龄(38.9±1.6)周(37～41周)；出生体重(3 428±375)g(2 650～3 950 g)；男32例，女28例。
60份新鲜母乳培养器皿内均有菌落生长，4℃保存48、72、96 h菌落计数较新鲜母乳上升；－18℃和－20℃保存30、90 d较新鲜母乳下降，但差异均无统计学意义(P>0.05)。聚乙烯瓶和聚乙烯袋两组比较总菌落计数差异均无统计学意义(P>0.05)。见表1。
不同保存条件下母乳总菌落数含量比较(×10CFU/ml，
±s，n＝60)
不同保存条件下母乳总菌落数含量比较(×10CFU/ml，±s，n＝60)
| 储存方式 | 聚乙烯瓶 | 聚乙烯袋 | t值 | P值 | |
|---|---|---|---|---|---|
| 新鲜母乳 | 2.15±1.37 | 2.15±1.29 | 0.218 | 0.082 | |
| 4℃ | 48 h | 2.21±1.73 | 2.23±1.53 | 0.223 | 0.078 |
| 72 h | 2.63±2.09 | 2.60±1.79 | 0.356 | 0.090 | |
| 96 h | 2.68±1.96 | 2.67±1.91 | 0.317 | 0.073 | |
| －18℃ | 30 d | 1.93±1.58 | 1.90±1.62 | 0.209 | 0.062 |
| 90 d | 1.85±1.28 | 1.86±1.21 | 0.216 | 0.076 | |
| －20℃ | 30 d | 1.90±1.32 | 1.89±1.51 | 0.211 | 0.067 |
| 90 d | 1.86±1.19 | 1.85±1.39 | 0.213 | 0.070 | |
注：各组与新鲜母乳比较，P均>0.05
与新鲜母乳比较，各设定保存条件下母乳中脂肪、蛋白质、乳糖和能量含量呈下降趋势，保存时间越长，差异越明显，且差异有统计学意义(P<0.01)；与聚乙烯储奶袋储存比较，聚乙烯储奶瓶储存宏量营养素下降程度更小，但差异无统计学意义(P>0.05)。4℃保存时，与新鲜母乳比较，48 h母乳脂肪稍下降，72、96 h下降显著，差异有统计学意义(P<0.05)；而其余各成分至96 h时差异仍很小，无统计学意义(P>0.05)。－18℃保存时，与新鲜母乳比较，30 d母乳中脂肪、蛋白质、能量均有所下降，90 d显著下降，差异均有统计学意义(P<0.01)；母乳乳糖30 d无变化，90 d下降明显，差异有统计学意义(P<0.05)。－20℃保存与－18℃保存比较，各时间营养素含量差异无统计学意义(P>0.05)。见图1。
注：a与新鲜母乳比较，P<0.05
与新鲜母乳比较，各保存条件母乳TNF-α、IL-6、IL-10差异均有统计学意义(P<0.05)；母乳乳铁蛋白含量差异无统计学意义(P>0.05)；与聚乙烯储奶袋储存相比较，聚乙烯储奶瓶储存对免疫活性因子影响程度更小，但差异无统计学意义(P>0.05)。随着储存时间的延长，与新鲜母乳比较，IL-6含量呈逐渐下降趋势，差异有统计学意义(P<0.05)；IL-10含量呈上升趋势，但仅－18℃保存30、90 d上升较明显，差异有统计学意义(P<0.05)；TNF-α在4℃保存72、96 h时下降，－18℃保存30、90 d时上升，差异均有统计学意义(P<0.05)；其余各设定保存条件下母乳差异无统计学意义(P>0.05)。－20℃保存与－18℃保存比较，各时间免疫活性因子含量差异无统计学意义(P>0.05)。见图2。
注：a与新鲜母乳比较，P<0.05
冷藏和冷冻可以降低母乳温度，延缓母乳成分发生生物化学反应，防止微生物繁殖分解，但最终变化仍是由多因素决定的，如低温媒介、保存时间和温度、细菌种类等[8]。本研究中，所有新鲜母乳培养器皿内均有细菌生长，我们未进行细菌种属分类，仅比较总菌落数。与新鲜母乳比较，总菌落数4℃冷藏时保存72、96 h略有上升；－18℃和－20℃冷冻保存30、90 d有所下降，但差异无统计学意义。也有研究表明，新鲜母乳冷藏至48 h，甚至是冷冻保存均未影响总菌落数量[9]，本研究结果与之具有一致性。
目前公认能够快速简便、准确而稳定的检测母乳营养成分的工具是母乳分析仪[10]。本研究应用HLIFE全自动母乳分析仪，采用IR中红外技术测定新鲜母乳及不同保存条件下母乳各种营养素含量，包括脂肪、蛋白质、乳糖和热卡。结果显示，低温冷藏4℃保存48 h母乳中脂肪成分已经下降，保存72、96 h下降更加显著；但其余各成分含量至96 h时仍较稳定。－18℃冷冻保存时，与新鲜母乳相比较，只有乳糖在90 d才出现下降，其他各成分在30 d时已下降，90 d时下降显著。与－18℃保存条件相比较，－20℃保存时母乳主要营养成分含量无差异。翟英辰等[11]关于母乳低温保存的研究也表明，低温保存条件下脂肪最先出现下降，认为低温条件下脂肪酶仍存在一定活性，对脂肪仍有分解作用。本研究中母乳乳糖下降相对缓慢，可能与乳糖黏附于容器壁的速度缓慢有关，随着冷冻时间延长，黏附速度更加缓慢[12]。本研究中冷藏和冷冻90 d蛋白质含量和新鲜母乳均无明显差异，考虑低温过程中水分活度也很低，抑制了酶的连锁反应。但也有研究表明，冷冻时间达4个月时蛋白质含量会明显下降[13]。这有待于我们进一步的研究。由此可见，低温保存母乳也会导致其各种成分的一系列变化，且随着保存温度、时间的不同，变化亦不相同。
母乳各种成分是随着乳母种族、生活地域、饮食习惯以及不同泌乳阶段而不断变化的。因母乳中细胞因子成分及相互作用的复杂性，低温保存新鲜母乳时各细胞活性因子也出现不一致的变化趋势。本研究中，低温保存条件下IL-6含量呈逐渐下降趋势；TNF-α含量4℃冷藏保存时明显降低，－18℃冷冻保存30、90 d时TNF-α和IL-10均有所增加。乳铁蛋白在各保存条件下无明显变化。因此，从免疫活性物质方面来考虑，建议母乳－18℃冷冻保存不超过3个月。
对于新鲜母乳低温保存时的容器，目前尚无统一的推荐。有研究结果显示，由于脂溶性成分、白细胞等易黏附于玻璃瓶壁上，维生素会黏附于塑料瓶壁上，塑料瓶更适于保存新鲜母乳[14,15,16]。Chang等[17]使用9种不同容器保存冷冻母乳，结果显示9种不同容器间的母乳营养成分没有明显差异。Takci等[7]研究表明，新鲜母乳4℃保存时，与聚乙烯袋相比较，耐热玻璃瓶24、48 h的母乳抗菌活性显著增高，因此玻璃瓶更适用于新鲜母乳短期储藏保存。另外有研究在处理经低温保存后复温的母乳样本时发现营养素成分具有一定的黏附作用[11]。现在越来越多的家庭选择聚乙烯材质来保存新鲜母乳。本研究选用常用聚乙烯瓶和聚乙烯袋保存样本，结果显示聚乙烯瓶保存母乳时对各营养素成分的影响相对较小，但差异无统计学意义。这可能与各营养素分子对容器壁的黏附作用不同有关。
本研究结果表明，低温冷藏或冷冻保存新鲜母乳时，细菌总菌落数均无明显变化，因缺乏细菌具体种属分类变化，仍需进一步研究；冷藏、冷冻储存新鲜母乳对母乳宏量营养成分和免疫活性物质均会产生一定的影响，4℃冷藏72 h脂肪含量及IL-6明显下降，－20℃与－18℃冷冻保存时无明显差异；与袋装储存相比较，瓶装储存时母乳营养成分和免疫活性物质影响更小，但无显著差异。由本研究得出，新鲜母乳挤出后，使用袋装或瓶装储存均可，且一般家用冰箱保存时，4℃冷藏不超过72 h，－18℃和－20℃冷冻保存不超过90 d。本研究检测了低温保存时母乳成分中几项指标的变化，为明确母乳储存的最佳模式提供了一定的依据，有助于更好的为住院新生儿尤其是早产儿提供母乳喂养。但鉴于母乳成分复杂多变，研究时间和规模有限，仍需进一步进行母乳保存的研究。
所有作者均声明不存在利益冲突
