探讨徐州地区新生儿苯丙酮尿症（phenylketonuria，PKU）筛查特征及构建徐州地区苯丙氨酸羟化酶（phenylalanine hydroxylase，PAH）基因和四氢生物蝶呤缺乏症相关基因突变谱。
选择2015年11月至2020年3月徐州地区出生并采用串联质谱技术进行苯丙氨酸（Phe）及苯丙氨酸与酪氨酸比值（Phe/Tyr）测定的新生儿资料进行回顾性研究，应用高通量测序联合Sanger测序技术对苯丙氨酸异常患儿进行基因分析。
共计完成450 355名新生儿苯丙氨酸相关指标测定，确诊115例PKU，患儿Phe及Phe/Tyr比值显著升高，PKU发病率为1∶3 916。其中PAH基因突变113例，PTS基因突变2例。PAH基因突变患儿中纯合子突变5例，PAH合并PTS双基因突变1例，PAH基因3位点突变2例。PAH基因高频突变类型为2号外显子错义突变，常见基因突变主要包括c.158G>A （p.R53H） （24.7％，56/227）、c.728G>A （p.R243Q） （15.0％，34/227）、c.611A>G （p.Y204C） （5.3％，12/227） 、c.721C>T （p.R241C） （5.3%，12/227）和c.1068C>A （p.Y356X） （4.8％，11/227）。共发现3个新的PAH基因突变（c.234dupA、c.441+15C>G和c.1096C>T）及1个新的PTS基因突变（c.286G>A）。
徐州地区PKU较常见，属于PKU高发地区，基因突变以PAH基因突变为主。
苯丙酮尿症（phenylketonuria，PKU）是最常见的一类氨基酸代谢障碍性疾病，主要由于肝细胞内苯丙氨酸羟化酶（phenylalanine hydroxylase，PAH）活力降低或缺乏，致使苯丙氨酸（phenylalanine，Phe）向酪氨酸（tyrosine，Tyr）转化时发生障碍，或者在转化过程中辅助因子四氢生物蝶呤（tetrahydrobiopterin，BH4）缺乏导致PAH催化功能障碍［1, 2］。目前，传统茚三酮荧光筛查技术检测时间较长，且无法进行Tyr的测定，对于Phe/Tyr比值异常无法及时检出，因此，串联质谱技术应运而生，使患者从中获益。
根据我国流行病学分析，徐州地区及周边地区属于PKU高发地区，2003年开始采用传统茚三酮时间分辨荧光分析法，为了提升疾病筛查检出率，2015年底本中心引入串联质谱技术。本研究分析串联质谱检出的115例PKU患儿基因突变谱特征，同时分析串联质谱Phe浓度及Phe/Tyr比值，结合生物信息学方法研究本地区串联质谱应用以来PKU的发生情况［3］，以助于该疾病的遗传咨询及临床诊疗。
选择2015年11月至2020年3月徐州地区出生、在徐州市妇幼保健院新生儿筛查中心进行串联质谱遗传代谢病筛查并确诊PKU的新生儿进行回顾性分析。入选标准：新生儿在父母签署知情同意书后完成串联质谱检测，高度疑似患儿（即串联质谱初次筛查Phe浓度大于1 200 μmol/L或连续两次串联质谱检测Phe浓度大于100 μmol/L并伴随 Phe/Tyr升高）送检尿蝶呤谱，患儿及其父母进行基因检测及家系验证。本研究获得徐州市妇幼保健院伦理委员会审批，［2019］伦审第（08）号，所有检测项目均获得新生儿监护人的知情同意。根据检测结果将入选研究对象分为初筛正常组、召回复查正常组及PKU确诊组。
1.血Phe浓度测定：采用串联质谱法检测血Phe浓度及Phe/Tyr比值。参考区间：Phe浓度25~100 μmol/L，Phe/Tyr比值0.18~1.2。通过试剂盒配套Phe干血片质控品及国家卫生部临床检验中心的室间质控品完成实验的质控分析。初筛检测值超出上限为可疑阳性，立即召回复查，高度疑似患儿进一步做尿蝶呤谱及基因诊断；初筛Phe浓度≥1 200 μmol/L直接做进一步诊断检测。
2.基因诊断：DNA提取、捕获及建库，并进行测序及变异分析。针对患儿致病基因突变，通过Sanger测序进行家系位点验证。
3.生物信息分析：从美国国立生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）的Protein数据库获取不同物种PAH蛋白质序列信息，应用GeneDoc软件分析不同物种间PAH氨基酸保守序列信息；应用Phyre2在线工具对确诊的新发突变类型进行氨基酸突变分析，并应用PBD数据库信息对外显子突变进行氨基酸三维模拟分析，分析基因突变对其所在外显子蛋白结构和功能的影响。
4.诊断标准：根据高苯丙氨酸血症诊治共识［4］，复查血Phe浓度>120 μmol/L及血Phe/Tyr比值>2.0 统称为高苯丙氨酸血症。所有患儿排除BH4缺乏症后，血Phe浓度≥ 1 200 μmol/L为经典型PKU；360 μmol/L≤Phe浓度<1 200 μmol/L为轻度PKU；120 μmol/L<Phe浓度<360 μmol/L为轻度高苯丙氨酸血症。
应用SPSS 22.0统计软件进行数据分析。正态分布的计量资料以表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用t检验。P<0.05为差异有统计学意义。
研究期间徐州地区共完成450 355名新生儿串联质谱遗传代谢病筛查，初筛正常450 084名，初筛可疑阳性271例，召回复查268例，复查正常153例，确诊PKU 115例，其中PAH基因突变113例，PTS基因突变2例。PAH基因突变患儿中纯合子突变5例，PAH合并PTS双基因突变1例，PAH基因3位点突变2例。未检出其他相关致病基因突变。
初筛正常组Phe浓度集中在40~80 （52.1±11.0） μmol/L；初筛可疑阳性召回复查正常组初筛Phe浓度集中在100~150 （129.4±24.9） μmol/L；复查后确诊PKU患儿初筛Phe浓度 （402.8±430.1） μmol/L，高于初筛正常组和召回复查正常组，差异有统计学意义（P<0.05）。见图1A。确诊PKU患儿初筛Phe/Tyr比值也明显高于其他2组，差异有统计学意义（P<0.05），见图1B。
注：PKU为苯丙酮尿症，Phe为苯丙氨酸，Tyr为酪氨酸；与初筛正常组比较，aP<0.05，bP<0.001
确诊的115例PKU患儿中BH4缺乏症2例，PAH缺乏症113例。PAH缺乏症中轻度高苯丙氨酸血症最常见，其次是经典型PKU，轻度PKU较少，见表1。
PAH基因突变患儿临床分型[例（%）]
PAH基因突变患儿临床分型[例（%）]
| 突变类型 | 例数 | 经典型PKU | 轻度PKU | 轻度高苯丙氨酸血症 |
|---|---|---|---|---|
| 纯合突变 | 5 | 2 (1.8) | 2 (1.8) | 1 (0.9) |
| 复合杂合突变 | 108 | 23 (20.4) | 14 (12.4) | 71 (62.8) |
| 合计 | 113 | 25 (22.1) | 16 (14.2) | 72 (63.7) |
注：PAH为苯丙氨酸羟化酶，PKU为苯丙酮尿症
113例PAH基因突变患儿的227个等位基因共检出PAH基因变异57种。其中纯合变异5例，复合杂合变异108例。包括错义突变42种（73.7%），剪接变异10种（17.5%），缺失突变4种（7.0%），重复突变1种（1.8%）。47种位于外显子，10种位于内含子。PAH基因突变类型以错义突变最为常见，高频突变依次为第2外显子c.158G>A （p.R53H） （24.7％， 56/227）和第7外显子c.728G>A （p.R243Q） （15.0％， 34/227），主要突变见表2。
徐州地区串联质谱筛查主要PAH基因突变
徐州地区串联质谱筛查主要PAH基因突变
| 序号 | 例数 | 突变定位 | 基因突变(PKU NM_000277.1) | 基因突变总频率 (%) | 突变类型 | 致病性 | |
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 核苷酸改变 | 氨基酸改变 | ||||||
| 1 | 56 | Exon 2 | c.158G>A | p.R53H | 24.7 | 错义突变 | 良性 |
| 2 | 34 | Exon 7 | c.728G>A | p.R243Q | 15.0 | 错义突变 | 致病 |
| 3 | 12 | Exon 6 | c.611A>G | p.Y204C | 5.3 | 错义突变 | 致病 |
| 4 | 12 | Exon 7 | c.721C>T | p.R241C | 5.3 | 错义突变 | 致病 |
| 5 | 11 | Exon 11 | c.1068C>A | p.Y356X | 4.8 | 错义突变 | 致病 |
| 6 | 11 | Exon 12 | c.1238G>C | p.R413P | 4.8 | 错义突变 | 致病 |
| 7 | 9 | Exon 3 | c.331C>T | p.R111* | 4.0 | 错义突变 | 致病 |
| 8 | 7 | Exon 12 | c.1301C>A | p.A434D | 3.1 | 错义突变 | 致病 |
| 9 | 6 | Exon 3 | c.208_210del | p.S70del | 2.6 | 缺失突变 | 致病 |
| 10 | 5 | Intron 4 | c.442-1G>A | - | 2.2 | 内含子剪接 | 致病 |
| 11 | 3 | Exon 5 | c.466G>C | p.A156P | 1.3 | 错义突变 | 致病 |
| 12 | 3 | Exon 11 | c.1174T>A | p.F392I | 1.3 | 错义突变 | 致病 |
| 13 | 3 | Exon 11 | c.1197A>T | p.V399V | 1.3 | 错义突变 | 致病 |
| 14 | 3 | Exon 2 | c.115_117del | p.F39del | 1.3 | 缺失突变 | 致病 |
| 15 | 3 | Exon 7 | c.722del | p.R241Pfs*100 | 1.3 | 缺失突变 | 致病 |
| 16 | 2 | Exon 6 | c.688G>A | p.V230I | 0.9 | 错义突变 | 致病 |
| 17 | 2 | Exon 10 | c.977G>A | p.W326* | 0.9 | 错义突变 | 致病 |
| 18 | 2 | Exon 11 | c.1199G>C | p.R400T | 0.9 | 错义突变 | 致病 |
| 19 | 2 | Exon 12 | c.1223G>A | p.R408Q | 0.9 | 错义突变 | 致病 |
| 20 | 2 | Intron 6 | c.707-1G>A | - | 0.9 | 内含子剪接 | 致病 |
| 21 | 2 | Intron 7 | c.842+2T>A | - | 0.9 | 内含子剪接 | 致病 |
| 22 | 2 | Intron 8 | c.913-7A>G | - | 0.9 | 内含子剪接 | 致病 |
注：PAH为苯丙氨酸羟化酶，PKU为苯丙酮尿症, Exon为外显子，Intron为内含子
PAH基因突变在徐州地区呈现区域分布差异，徐州市区（包含贾汪区及铜山区）PAH基因突变较多，以c.158G>A为主。而丰县和沛县两个区域PAH突变发生率显著低于其他地区。113例PAH基因突变患儿中，58例完成了家系基因验证，占51.3%，其中3个家系验证父母双方携带相同致病突变，占5.2%，患儿为纯合突变型。
经检索，PAH基因c.441+15C>G（4号内含子）、c.234dupA（p.F79Ifs*7）和c.1096C>T（p.P366S）在国内外相关文献、PAH数据库（ www.biopku.org） 和人类基因突变数据库（Human Gene Mutation Database，HGMD）尚无报道。第79位的Phe及第366位Pro在不同物种间高度保守。上述3种突变虽然均不在PAH蛋白的活性口袋区域，但是位于PAH蛋白两个结构域链接处，是蛋白质正确折叠的关键，尤其第148位Glu位于两个α-螺旋之间，当c.441+15C>G发生突变时，可能影响PAH基因的mRNA剪接，从而影响蛋白质的结构形成。
2例PTS基因突变患儿的6个等位基因共检出PTS基因变异3种，均为复合杂合突变，其中c.286G>A为新发突变，2例患儿均未进行父母位点验证，见表3。
四氢生物蝶呤缺乏症患儿基因型及串联质谱分析
四氢生物蝶呤缺乏症患儿基因型及串联质谱分析
| 序号 | 性别 | 基因突变(PTS NM_000317.2) | 串联质谱筛查结果 | 召回复查串联质谱结果 | |||
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 核苷酸改变 | 氨基酸改变 | Phe浓度（μmol/L） | Phe/Tyr比值 | Phe浓度（μmol/L） | Phe/Tyr比值 | ||
| 1 | 女 | c.3G>A | p.M1 | 537.75 | 8.342 | 1 218.46 | 18.054 |
| c.84-291A>G | p.Y27Rfs*8 | ||||||
| 2 | 男 | c.84-291A>G | p.Y27Rfs*8 | 143.82 | 2.195 | 328.47 | 4.4 |
| c.286G>A | p.D96N | ||||||
注：Phe为苯丙氨酸，Tyr为酪氨酸
PKU是一类常见的常染色体隐性遗传性氨基酸代谢病，是少数可以治疗的遗传代谢病［5］。PKU患儿早期及时诊断与治疗，可以显著降低神经系统的不可逆损伤，因此，新生儿遗传代谢病的筛查非常重要。而基因测序及家系位点验证可以为患儿提供“精准医疗”的依据，同时也可为已生育PKU患儿的家庭提供优生遗传咨询。
PKU的发病特征与种族、地区等有关，欧洲报道的发病率约1∶10 000 ［6, 7］，其中土耳其发病率较高，约1∶6 000，阿拉伯联合酋长国发病率较低，约1∶20 000［8］。北美地区发病率约为1∶15 000 ［9］。亚洲地区日本发病率为1∶120 000［10］，韩国报道发病率为1∶41 000［11］。根据不完全数据统计，我国发病率约为1∶11 144，高于亚洲其他国家，北方发病率高于南方，中、西部高于东部，地区差异性显著［12, 13］。本研究中，采用串联质谱技术对江苏徐州地区450 355名新生儿样本进行Phe筛查，累计检出PKU患儿115例，其中2例为BH4缺乏症患儿，累计发病率为1∶3 916，远高于全国平均水平，且与江苏其他地区差异较大，但与周边山东地区发病率接近，这可能与徐州地理位置和人口特征相关。
开展串联质谱筛查可以对Phe及Phe/Tyr比值进行精准测定，有助于Phe异常的检出［14］。本研究结果显示，Phe/Tyr比值的测定有助于BH4缺乏症的筛查，同时，串联质谱对Phe浓度测定的高灵敏度有助于Phe浓度100~120 μmol/L高苯丙氨酸血症的筛查，而早期及时筛查使这些轻度、无症状患儿及时确诊，有效预防神经不可逆损伤的发生，提高PKU患儿生存质量［15］。
PAH基因突变与PKU的发生相关，该基因位于人类12号染色体长臂（12q23.2），包含13个外显子和12个内含子，目前报道的该基因突变主要发生在外显子上，以错义突变为主，占60%以上［16, 17］。1982年PAH基因被克隆后，目前全球已报道的该基因突变有564 种，我国人群中已报道的PAH基因突变有100多种。本研究结果显示，徐州地区113例PAH基因突变患儿也是以错义突变为主，突变频率高达73.7%（42/57）。PAH基因突变随地域、种族及人口呈现显著的遗传异质性，欧美地区报道最常见的PAH基因突变是R408W（第12号外显子），我国报道人群常见突变为R243Q（第7号外显子）［18, 19］，同时，Li等［20］研究显示，我国人群中PAH基因突变频率南北方差异显著（P<0.05）。本研究对徐州地区113例PAH基因突变进一步分析结果显示，突变频率较高的突变主要是c.158G>A和c.728G>A。与全国报道相比，第2号外显子R53H是本地区最常见的突变类型，与福建泉州地区报道相似［19］。根据美国医学遗传学与基因组学学会遗传变异分类标准与指南，对c.158G>A突变的致病性重新评估后，虽然该位点在HGMD数据库收录为致病突变，但临床变异（Clinical Variant）在2019年12月已再次将该位点从临床意义未知的变异更新为良性。本地区该位点突变的患儿均为复合杂合突变，且串联质谱检测指标均升高，临床建议按照PKU患儿进行随访诊疗。此外，本研究报道了3种PAH基因的新发突变，包括c.234dupA （p.F79Ifs*7）、c.441+15C>G（4号内含子）及c.1096C>T （p.P366S）。通过生物信息学分析确定上述3种新发基因突变类型在不同物种间均是高度保守的，通过在线预测，上述位点变异可能通过影响蛋白质连接或剪接而改变PAH活性及功能，但其与疾病的相关性有待后续更多验证。
BH4缺乏症由PTS、QDPR、GCH1、PCBD1和SPR基因调控，全球报道病例中以PTS基因突变为主［21, 22］。我国人群中的主要致病基因也是PTS基因［23, 24］，南方以N52S最常见，北方以D96N和K91R最常见，而P87S和c.84-291A>G南北方均较常见。本研究结果显示，徐州地区PTS基因突变患儿较少见，仅确诊2例。
综上所述，本研究通过对115例PKU患儿的新生儿串联质谱筛查及基因测序结果进行分析，初步归纳了徐州地区PKU发病情况及相关基因PAH、PTS基因谱特征。因本研究纳入分析的确诊病例数有限，涉及病例追踪时长也较短，作为一种遗传代谢性疾病的研究，对于家系的追踪缺乏系统性，尚存在一定的局限性。但是基于40多万新生儿筛查基数的分析［25, 26］，本研究丰富了徐州地区PKU相关基因谱，有助于本地区人口优生遗传咨询的开展，推动国家出生缺陷防控在徐州地区的落实。
所有作者均声明不存在利益冲突
