在过去20年中，通过GWAS和随后对GWAS数据的Meta分析成功地确定了IBD的易感基因。使用GWAS技术筛选出200多个与IBD相关的风险位点。在此基础上，确定了IBD致病基因20余个，包括NOD2、CARD9、IL23R、ATG16L1、IRGM等。这些基因涉及上皮屏障、黏膜免疫、自噬、凋亡、T细胞与B细胞功能调节等各环节^[7]。根据易感基因差异性表达，为患者选择特异性靶点进行精准治疗，将为临床提供更切实的帮助。

IBD发病往往伴随基因的表达改变，包括RNA及蛋白水平，差异显著的基因往往是调控IBD发病的潜在分子。差异筛选的常用技术为RNA/蛋白芯片、高通量测序以及蛋白质谱。高通量测序主要为二代测序（"next-generation"sequencing technology，NGS），质谱法（mass spectroscope，MS）可以使用同位素标记相对和绝对定量（isobaric tags for relative and absolute quantitation，ITRAQ）、串联质量标签（tandem mass tags，TMT）标记蛋白，定量检测蛋白水平。芯片技术仅限于对已知RNA或蛋白的检测，对功能不同的RNA变异体或未知蛋白不敏感，检测低丰度RNA或蛋白的假阳性率较高。MS与NGS相似，相比芯片，其检测到的RNA或肽段的通量较高，可提供更大的覆盖范围，具有挖掘新RNA及蛋白的潜力。另外，随着组学的发展，多组学分析也受到关注。在IBD研究中，转录组与蛋白组联合分析，能区分基因在转录及蛋白水平的不同变化^[8]。

对特定基因的表达定量方法，常规包括RNA水平的定量逆转录聚合酶链式反应PCR（reverse transcription-PCR，qRT-PCR）、southern印记杂交（southern blot）、原位杂交（in situ hybridization，ISH），以及蛋白水平的免疫印迹法（western blot）、免疫组织化学（immunohistochemistry，IHC）、免疫荧光（immunofluorescence，IF）、流式细胞术（flow cytometry，FCM）。其中qRT-PCR及western blot可对基因表达做半定量分析，是最常用的表达检测手段。免疫组织化学及免疫荧光主要用于检测IBD组织切片中的目标蛋白水平，通过染色深浅和荧光强度可判定蛋白表达高低，但不能精准定量其水平；免疫组织化学及免疫荧光还可确定目标蛋白在细胞中的定位为胞质、胞核还是胞膜；尤其免疫荧光，可同时标记2 ~ 3个蛋白分子，联合共聚焦显微镜，不仅能确定蛋白的共定位，若与细胞器特有蛋白共标，还可确定目标蛋白的亚细胞器定位。此外，流式细胞术也可用于分析目标蛋白的表达和定位，其荧光定量更为精准，可标记的蛋白通量更高，可检测目标蛋白在不同细胞亚群之间的水平变化，但无法可视化。

非编码RNA（non-coding RNA，ncRNA）是指不编码蛋白质的RNA。目前在IBD中研究比较多的是短链microRNA（miRNA）和长链lncRNA^[9,10]，其余还包括环状RNA（cirRNA）、转运RNA（tRNA）、核糖体RNA（rRNA）和PIWI互作RNA（piRNA）等。

针对ncRNA的多数研究，首先对IBD患者组织的差异表达的ncRNA进行了筛选。就对象而言，患者组织比模型动物更具有筛选价值，在后期研究中更具临床指导意义。筛选手段采用芯片或NGS技术。例如，2008年Wu等^[11]首次用芯片技术，比较了活动期溃疡性结肠炎（UC）、非活动期UC、慢性活动性克罗恩病（CD）与健康对照者的miRNAs表达，发现了55个miRNAs在活动期组织中增加。Peck等^[12]基于NGS-RNA测序，确定miR-31-5p，miR-215和miR-223-3p在CD中升高。此外，Qiao等^[13]通过芯片对比病变及正常组织发现DQ786243与CD的严重程度有关。

验证目标ncRNA的水平，主要采用qRT-PCR或者Northern blot，联合原位杂交技术可大体确定其细胞定位。生物信息学预测结合双荧光素酶报告系统可认证miRNAs的靶点，甚至miRNA与lncRNA的相互作用。用于miRNA靶点预测的主要在线软件为Targetscan、PITA、miRanda、miRDB等，而lncRNA的靶点预测尚没有较为成熟的方法。通过调节目标lncRNA，应用RNA-pulldown联合质谱法可辅助寻找与lncRNA结合的蛋白。RNA结合蛋白免疫沉淀（RNA binding protein immunoprecipitation，RIP）可验证与蛋白质结合的lncRNA。

IBD相关的DNA甲基化研究大多集中在UC患者，主要针对组织活检标本。Gloria等^[14]首次通过研究26例病程为7年以上的患者和11名健康者，报道了DNA甲基化与UC的发病机制有关。随后有研究也检测到E-cadherin、p16（P16INK4a）、Cdh1、GDNF和MDR1等多基因在UC患者中有高频率的启动子甲基化，并已证实DNA甲基化与类固醇依赖性结肠炎的疗效有关^[15]。

在IBD的背景下，DNA甲基化的检测技术大致可分为两类：特异位点的甲基化检测和全基因组的甲基化分析，后者也称甲基化图谱分析（methylation profiling），这些方法均需要对样品DNA做亚硫酸氢盐处理。

特异位点的甲基化检测主要包括甲基化特异性PCR（MSP）、亚硫酸氢盐处理后测序（BSP）以及焦磷酸测序。MSP可用于石蜡包埋样本，是较为经济传统的方法，但需要知道待测片段的DNA序列，并设计出好的引物。BSP一度被认为是DNA甲基化分析的金标准，可靠、精确，能明确每一个CpG位点的甲基化状态，但需要大量的克隆测序。焦磷酸测序亦可对甲基化位点进行定性及定量检测，优势是检测快速。

IBD甲基化图谱分析，通常使用芯片研究黏膜组织的全基因组DNA甲基化。Infinium Human Methylation 450 BeadChip芯片以单碱基分辨率覆盖了每个样品中超过45万个甲基化位点，实现了对CpG岛，甚至之外的CpG位点的高覆盖度，是勾勒甲基化图谱的理想选择^[16,17]。此外，高通量测序、飞行质谱也可研究甲基化图谱，但价格昂贵，目前在IBD研究中的应用不多。

乙酰化是蛋白修饰的主要形式之一。相比甲基化研究，蛋白乙酰化在IBD中的研究较少。以Ⅲ类NAD依赖的去乙酰化酶SIRT1和组蛋白去乙酰化酶（histone deacetylase，HDAC）抑制剂的研究最多。其中，Lo等^[18]与Melhem等^[19]先后在小鼠和大鼠IBD模型中报道了SIRT1在抗菌以及在甲基供体缺乏大鼠结肠炎中的作用。此外，HDAC抑制剂亚氧基苯胺羟肟酸（SAHA）可缓解DSS诱导的小鼠结肠炎^[20]，具有较好的应用前景。

在IBD相关乙酰化酶的筛选中，芯片技术得到了应用。2016年Bai等^[21]通过芯片分析CD和UC患者的直肠、乙状结肠、升结肠和回肠末端炎症反应和相邻的非炎症反应组织，发现了116个表观遗传相关的差异基因，并证实了赖氨酸乙酰基转移酶2B（KAT2B）的作用。酰基化酶活力的检测可采用比色法。例如，Chi等^[22]采用比色法测定了HT-29细胞内HDAC活性。

对已知酰基化靶点检测和广谱靶点筛选，可联合修饰酶的基因敲除、抑制剂或激活剂处理。例如，为鉴定IBD中KAT2B影响的组蛋白修饰位点，Bai等^[21]给予正常人结肠上皮细胞系NCM460以小分子拮抗剂槚如酸（anacardic acid，AA）处理以抑制KAT2B，通过western blot检测了已知的组蛋白3和4位赖氨酸残基的乙酰化水平。广谱筛选可能的靶点，可采用特定氨基酸乙酰化抗体富集，之后进行质谱分析。在酰基化靶点的验证方面，Lo等^[18]通过体外乙酰化/脱乙酰化实验，证实了p300可乙酰化含SAM结构域的Ets转录因子SPDEF（SAM pointed domain-containing Ets transcription factor，SPDEF）和SIRT1。

肠相关免疫细胞的研究主要关注肠黏膜组织内淋巴细胞，包括上皮内淋巴细胞（intraepithelial lymphocyte，IEL）、固有层淋巴细胞（lamina propria lymphocyte，LPL）、肠黏膜淋巴结以及派氏淋巴集合。组织内淋巴细胞的分离方法常用乙二胺四乙酸（EDTA）联合胶原酶消化，即首先用EDTA去除上皮层，通过40%的淋巴细胞分离液分离出IEL；接着对残留组织进行Ⅳ型胶原酶消化，通过40%和70%淋巴细胞分离液分离获得LPL。操作过程中保持低温，并使用含有1%胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）的缓冲液，可保持较好的细胞活力^[23]。

流式细胞术（flow cytometry，FCM）是对悬液中的单细胞，通过检测标记的荧光信号，实现高速、逐一的细胞定量分析和分选的技术。FCM使用以来，相继发现了IBD相关的各类细胞亚群。此外，酶联免疫吸附实验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）在检测IBD患者血清中的炎性因子中得到了应用，是炎性因子主要的定量方法。在特定免疫细胞的分选中，流式细胞术与磁珠分选是最主要的方式。磁珠分选适用于单标记的细胞分选，速度比较快，但不适用于需要多重标记的细胞分选。流式细胞仪可以同时识别多个细胞表面标记，可用于多标记细胞的分选。

质谱流式细胞技术（mass cytometry，CyTOF）将流式细胞技术与质谱分析技术结合，这种融合技术能在单细胞水平上同时分析超过40种细胞参数，极大增加了流式细胞分析评估复杂细胞的能力。质谱流式细胞技术利用质谱原理对单细胞进行多参数检测的流式技术，继承了传统流式细胞仪的高速分析的特点，又兼具质谱检测的高分辨能力，已被用于分析外周血、脾脏、皮肤、肝脏和肺的细胞亚群，在IBD研究中也受到关注。van Unen等^[24]设计了一个由32种金属同位素标记的单克隆抗体组成的CyTOF面板，全面了解分析了包括十二指肠活检、直肠活检、肛管瘘、外周血的单个细胞悬液，根据它们的免疫组成对样本进行聚类，分析了IBD患者的先天免疫系统和适应性免疫系统的异质性。此外，Chuang等^[25]取CD患者肠黏膜组织和血液标本，用CyTOF比较集落刺激因子2受体β（colony stimulating factor 2 receptor beta，CSF2RB）和NOD（nucleotide-binding oligomerzation domain，NOD）样蛋白NOD2在肠道的表达，对CSF2RB蛋白进行了高度精细的细胞定位。Tyler等^[26]探究了应用质谱流式作为研究IBD发病机制的工具，进一步证实质谱流式能够分析肠炎细胞浸润和相应的分子指纹，具有前所未有的分辨率，也为评估新药对肠道免疫成分的作用和机制研究提供了宝贵工具。

总之，IBD研究的基础方法涉及分子生物学、免疫学、实验动物学、遗传学等诸多方面。常规的细胞及分子生物方法是揭示IBD的发病机制，寻找干预措施或进行药物评估的必要手段。随着表观遗传学在IBD发病机制中的重要性逐渐被认知，以及免疫治疗在多种炎症性疾病的治疗中获得突破，表观遗传学与免疫治疗已然成为IBD基础研究的热门领域。除此之外，新的领域还涉及微生物和代谢。采用高通量测序、变性梯度凝胶电泳（polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis，PCR-DGGE）等方法对肠道微生物的DNA进行测定，以揭示IBD的肠道微生态，或通过液相色谱-质谱联用（LC-MS）检测代谢组（metabolome），获得代谢指纹，可能成为IBD诊断的新方向。因此，了解并恰当地应用相关研究策略及方法，将有助于全面而深入地解析IBD发病机制，并提出新的诊治策略。