肠道微生物群是定居在宿主消化道内的肠道微生物的总称。研究表明，许多疾病都与肠道菌群的改变密切相关。在复杂生态系统中使用高通量测序技术，即16S rRNA测序及元基因组测序，极大地丰富了肠道微生物组数据库，也鉴定出了很多细菌新种，促进了肠道微生物组与健康和疾病关系的研究。但测序技术也存在明显的不足，如DNA提取差异、引物偏差、测序深度偏差及分析偏性等。而早期被忽略的培养组学研究，由于方法的改进，能培养出更多的肠道细菌，发现了很多测序中无法鉴定到的新物种。这对促进肠道微生物群株水平的研究具有重要的意义。本文主要讨论目前常用的肠道菌群研究的方法及其应用。
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肠道微生物群是一个存在宿主消化道内的由细菌、病毒、真菌和原生生物等构成的复杂群落。人类肠道微生物群中，仅细菌而言，估计就有数千种，也是目前被研究最多的物种，因此，又习惯地被称为肠道菌群[1]。肠道菌群和肠道疾病、肥胖、代谢综合征、关节炎、老年痴呆、自闭症等有关，甚至和抗癌药物疗效也相关。随着检测手段的不断改进，与人类样本相关的肠道菌群基因组DNA测序的通量和准确性大幅提高，培养组学成功得到应用，多组学的交叉分析持续完善，研究者能更深入了解肠道菌群的结构和功能。我们对现在广泛使用的几种肠道菌群的研究方法进行论述，分析其优势与不足，以及可能的改进策略。
测序是指对核苷酸序列进行解码的分子过程。二代测序技术（next-generation sequencing，NGS）使快速和高通量的分析成为可能，已成为研究肠道微生物群的重要方法。细菌16S rRNA基因的靶向NGS高通量测定能以极低的成本对肠道菌群进行分析，极大地丰富了我们对这种复杂生态系统的认识，可指导疾病的预防或干预策略的制定[2,3]。
微生态学领域研究的一个主要方法是对高度保守的16S rRNA进行靶向分析，该基因是细菌和古生菌分类和多样性研究最广泛使用的系统发育标记[4]。16S rRNA扩增子NGS测序可实现复杂细菌群落的高通量分析，其成本低，比对数据库较完善，已成为生态系统研究中细菌快速分类的公认标准。
16S rRNA具有保守区和可变区，单个或多个可变区的测序是NGS目前应用最广的策略，可实现双向300 bp PCR片段的测序[3]。然而，用NGS测定不同可变区会导致分析的偏差，只能获得细菌属及以上分类水平的有效分辨率，在一定程度上限制了微生态的研究。此外，数据库中标记为环境样本的细菌16S rRNA记录中有很大一部分是未分类的，这部分是由于低读取精度、PCR扩增过程中产生的潜在嵌合序列以及短扩增子的低分辨率造成的。因此，有研究者利用三代测序进行全长16S rRNA测序分析，实现微生物组研究的整体比较，但目前这种方法成本较高，大部分研究还是采用了不同区域测序的策略[5]。
元基因组学（metagenomics，有文献翻译为"宏基因组"）分析技术最初是用来描述复杂环境微生态系统的组成，如海水中微生物种群特征。随后，研究者用该技术发现人类粪便或结肠活检样本中肠道微生物群的多样性，并与疾病进行关联研究。目前元基因组学已被广泛用于生理或疾病相关的肠道微生物群分析。除了分类鉴定之外，微生物DNA的元基因组测序还可以对基因进行功能性注释，以分析群落潜在的功能[6]。
生物信息学使我们能够在不进行传统分类的情况下，使用相似算法或聚类工具对整个序列数据集进行分析。由于实验流程不同，特别是提取DNA或生物信息学分析方法的不同，不同实验室间研究结果比较受到一定限制。此外，由于测序检测敏感性受测序深度影响较大，不同实验室的结果可能会偏差较大；当有足够的读取深度（也称为序列覆盖率）时，可以获得相对可信的分类结果。但是，对培养组学技术和高通量测序方法的检测结果同时进行比较的报道不多，因此，评估既往研究中分析策略的有效性存在困难[7]。每克粪便样本中含有约1013个细菌，元基因组测序可以检测106细菌/g粪便，16S rRNA测序可以检测到104细菌/g粪便，培养组学技术能够检测到102细菌/g粪便，尽管测序深度有所改善，各种技术间还是会产生菌群分类结果的很大差异。各种方法只能获得菌群的部分信息，对整体的一部分（很大程度上不同研究获取的不同的部分）进行比较，必然存在难以全面客观反映整体信息的缺点。除了测序深度偏差之外，由于肠道微生物群中很多还没有得到分离培养，测定的许多序列还不能分类；另外，测序技术不能确定所检测到的细菌是死还是活的，因此，用测序法测定微生物的活性和生理状态也是一项挑战。
测序技术可以在不需要培养的条件下进行混合细菌的鉴定，特别是一些目前还无法培养的细菌可通过测序分析，极大丰富了肠道微生物的数据库。同时，有了测序数据的支撑，也使得研究者有信心对培养困难甚至既往不能培养的细菌进行深入分析。通过基于基因组的代谢特征分析，有助于改良培养基及其培养方法，实现某些过去认为难以培养细菌的体外培养。高通量是测序技术的另一个主要优势。针对大样本的研究，只要能够提供满足测序要求的DNA，就可以对样本中可能存在的微生物进行分析。此外，研究者的测序数据通过上传到公共数据库，又为后续其他研究者进行多数据综合分析提供了物质基础。近期，研究人员通过从11 850个人类肠道微生物群中重建了92 143个通过元基因组组装的基因组，鉴定出1952个尚未培养的候选细菌物种[8]。这一工作揭示了未培养的肠道细菌的多样性，也为肠道微生物群的分类和功能特征提供了崭新的解决方案。
由于现有的NGS方法众多，对不同的研究进行无偏倚的比较仍然是一个挑战。DNA提取被普遍认为会直接影响微生物群研究的结果，但DNA提取是高通量微生物群研究的瓶颈[9]。目前所采用的DNA提取方法通常是手工提取，国际人类微生物组标准（IHMS）项目推荐的DNA提取方法也是手工的。但手动操作总是容易出现人为错误，这可能导致实验结果间的显著差异。尽管Claassen等[10]发现自动DNA提取方法比手工方法更有效地用于定量PCR方法，然而自动提取DNA的方法并没有被用于高通量16S rRNA测序。靶向16S rRNA可变区的不同对测序结果有显著影响，而且，测序数据的解释需要生物信息学家、生物学家和临床医生等一起讨论。
无论用哪种方法研究，样品采集的优化是多组学分析的关键；减少样本和数据处理的差异、优化分析微生物组数据的统计方法、设计微生物组的流行病学研究和制订结果报告与数据共享标准是取得高质量微生物组与健康关联研究的重要保障[11]。
目前已培养的14 300种原核生物中，只有2172种（约15%）从人身上分离出来[12]。稀释培养法有助于少数和难培养细菌的分离培养[13]。使用双层膜技术允许环境营养物质进入但限制细菌进入的培养装置可使培养的菌落数量增加300倍[14]。另外，通过测序信息，可以分析细菌生长必需的营养素和信号分子，有目的地添加会有助于高效分离目标菌，这种方法称为基因组指导的靶向细菌分离技术[15]。
研究者已经成功地在有氧环境中培养了瘤胃球菌、黑色普氏菌、坏死梭杆菌等肠道严格厌氧菌。La Scola等[16]的方法是补充了高剂量谷胱甘肽和抗坏血酸的Schaedler琼脂。Dione等[17]在培养基中加入不同的酸（如抗坏血酸、尿酸、及α-酮戊二酸等），使276种细菌（包括82种严格厌氧菌）成功在有氧状态下生长。
早期研究显示，在人类肠道中只发现了688种细菌和2种古细菌。而一项在对多份粪便样本开展培养组学的研究共培养了1057种原核生物，从而丰富了人类肠道微生物群中可培养细菌的种类[18]。接下来的研究陆续报道了从人体肠道分离出73种新物种，从尿路分离出13种新物种，从阴道分离出15种，从呼吸道分离出9种，从人体皮肤分离出2种，从人体初乳分离出1种，从骨髓炎患者的脚部分离出1种。与全部已经培养的细菌比较，培养组学使目前约23%的已培养细菌至少能从人类样本中培养出1次。
培养组学不仅使已知的人类相关细菌数量不断增加，而且还改变了用于描述未知细菌的方法。对一个新细菌种类报道的第一阶段，引入了分类基因组学的概念，以整合不同数据类型（如MALDI-TOF质谱和基因组测序数据）来描述新分离的细菌。这些研究还建立了新物种的公告格式，包括16S rRNA登记号和菌株编号等，以促进对新发现物种的交流与传播。
元基因组学测序不能从菌株水平区分细菌，也不能提供活菌供因果验证。因此，纯培养仍是表征微生物在健康和疾病中作用的关键环节。例如，报道显示早产儿坏死性小肠结肠炎与某些肠道细菌（如新生儿梭菌、产气梭菌、丁酸梭菌和尿致病性大肠杆菌）相关，研究者利用培养组学检测到患者体内的产毒丁酸梭菌，但元基因组分析没有观察到该菌的变化，只是后来回顾性分析才发现该菌的过度表达[19]。此外，只有培养才能确定该菌毒素分泌与否。
近年越来越多研究证实，肠道微生物对宿主免疫的影响及其在宿主免疫发育中的作用[20]。使用CTLA4（cytotoxic T lymphocyte associated antigen-4）阻滞剂治疗黑色素瘤的疗效取决于接受治疗个体的肠道微生物群组成[21]。在动物模型中，给予双歧杆菌增强了抗程序性细胞死亡配体-1（programmed cell death ligand，PD-L1）癌症免疫治疗的效果[22]。免疫调节治疗前的抗生素治疗显著降低了PD-1免疫治疗对晚期上皮癌的疗效[23]。由于肠道微生物群调节的重要性，获得肠道菌培养物是这种活菌药物伴随治疗的基础。
粪菌移植（fecal microbiota transplantation，FMT）目前在临床上治疗某些疾病（如难辨梭菌感染等）中发挥了重要作用。用功能明确的来自健康人肠道的细菌精准制备合成菌群做FMT是一重要方向。
16S rRNA测序被认为是一种通用的细菌物种鉴定方法，但其成本高、耗时长，限制了在高通量培养研究中的应用。因此，需要一种经济有效、快速的细菌鉴定筛选方法。
由于高质量鉴定数据库和分析技术的突破，MALDI-TOF质谱法快速鉴定细菌的技术现在已经普遍用于临床微生物实验室，实现了细菌属和种水平上的准确鉴定。MALDI-TOF质谱法既具有时效性又具有成本效益，其结果的可重复性以及培训的简便性使其在全球范围内得到了广泛应用，已成为临床微生物鉴定的参考方法[24]。如果没有快速细菌鉴定工具，培养组学方法是不可能有如今的发展，正是该技术的突破使得培养组学成为了探索包括人类肠道微生物群在内复杂生态系统的有效手段。
厌氧菌是健康人体微生物群的主要成员，特别是在人体肠道微生物群中。因此，在取样后应尽快将样本转移至厌氧环境，可以极大地增强厌氧细菌培养的概率。目前，已有不同的收集粪便样本的厌氧装置在专利申请中，实际应用效果还有待评价。至少研究者能做到的是尽可能缩短粪便在空气中的暴露时间，即使用尽可能新鲜的粪便样品开展培养。除了采样环节，培养专性厌氧菌也是微生物实验室面临的挑战。首先，需要特定的设备来提供无氧环境；其次，需要特殊的试剂，包括含有许多补充剂的复杂培养基，厌氧培养基必须含有碳源、微量元素、金属和一些生长因子。为了实现在厌氧条件下细菌的生长，人们先后设计了诸如厌氧罐、Gaspak系统和厌氧室等不同系统来培养细菌。
由于部分细菌在体外生长的优势，常常抑制难培养或生长缓慢的细菌，因此通过改变培养条件抑制生长过快的细菌，可以分离到更多的微生物。利用不同抗生素的特性，通过在培养基中加入适量浓度抗生素可以实现某些细菌生长抑制，如卡那霉素（10 mg/L）可以杀死革兰阴性细菌；万古霉素（10~50 mg/L）可以限制革兰阳性细菌生长。除了抗生素，临床上常用促进肠道细菌的分离的抑制剂，如胆汁提取物、曙红（eosin）、亚甲蓝（methylene blue，又称美蓝）、柠檬酸钠、硫代硫酸钠等。对于一些梭菌属和芽孢杆菌属细菌，可以用热休克处理粪便样本，不同的处理温度（65℃或80℃）和时长（20 min或1 h），都成功分离到目标细菌。此外，噬菌体的应用也是抑制某些特定细菌的方法之一。研究者使用T1和T4裂解性噬菌体，观察到培养板中细菌的生长下降了50%，也因此鉴定出细菌新种马赛肠杆菌（Enterobacter massiliensis）[25]。
另外，还可以通过额外使用添加剂来促进难生长细菌的培养。已证实血培养瓶中的成分可增加一些细菌的生长，如Lagier等[18]将粪便标本分别接种需氧和厌氧血培养瓶，分别在接种后第1、5、10、14、21、26和30天转接不同琼脂平板。这种血培养瓶及其培养策略效率较高，在发现的91个新种中，有50个是这种策略发现的。粪便抽提液已作为生长促进剂广泛用于人肠道古菌、厌氧菌以及大肠杆菌的培养，以及成年猪粪便中厌氧菌的分离。Goodman等[26]也用新鲜粪便抽提液改进了从人肠道分离细菌的高通量厌氧培养技术。有报道用瘤胃液的营养特性用于人肠道细菌培养组研究，如Gordon实验室将瘤胃液加入培养基组扩展了人肠道细菌库。研究者用培养组学鉴定的91个新菌种中，有30个是用瘤胃液作为特定营养分离到的[27]。此外，添加脂类和维生素也实现了一些细菌的首次分离。
利用16S rRNA或元基因组测序，极大丰富了肠道微生物组的数据库；而MALDI-TOF质谱技术在微生物学实验室中的有效应用也使得培养组学的鉴定工作快速前行；培养组学研究让大量早前被认为无法分离的细菌得以在体外实现培养，并鉴定出很多新物种。正是基于肠道菌群方法的改进，研究者们无论是在测序层面还是在培养物方面，都获得了大量与疾病相关的微生物标志物。同时，测序技术与培养组学是互补的。通过对来自不同地理和表型的3810个人类粪便基因组分析，重建了60 664个原核生物草图，这意味着肠道细菌序列的系统发育多样性增加50%[28]。这也为培养策略的改进提供了线索。另一研究基于1520个培养物测序结果提出了可培养参考基因组（CGR），其中264个并不存在于现存的参考基因组中[29]。研究者还提出了人类肠道细菌基因组集（HBG）和人类肠道细菌培养集（HBC）[30]。这些改进的肠道细菌参考序列集有助于克服对元基因组数据从头组装的依赖，使人肠道微生物群的元基因组分析更加准确、经济和高效。此外，如果辅以转录组、蛋白质组、代谢组和免疫组的分析，以及动物实验的验证，将极大地促进我们对肠道菌群结构和功能的理解，为实现其临床应用奠定基础。
需要强调的是，目前的微生物组学研究手段只是帮助我们获得局部信息，我们仍处于对人体微生物组与健康和疾病的"瞎子摸象"式研究阶段，研究技术需不断改进，分析方法需不断创新；同时，还不能忽视微生物组与宿主和环境的互作，综合研究这些因素才能更全面地了解微生物群对人体健康和疾病的影响。
作者均声明无利益冲突
