探讨溃疡性结肠炎（UC）患者结肠组织中维生素D受体（VDR）表达水平与Th17/调节性T细胞（Treg）比例失衡的关系。
回顾性收集30例UC患者和15例结肠腺瘤对照者的外周血和结肠组织标本，同时记录上述研究对象的临床资料。采用电化学发光法检测血清25-羟维生素D[25（OH）D]水平；采用免疫组化检测结肠组织中VDR、Th17细胞和Treg细胞相关因子[RORγt、白介素（IL）-17、Foxp3、IL-10]的表达水平。
UC患者结肠组织中RORγt、IL-17、Foxp3、IL-10表达水平及RORγt/Foxp3比值均高于对照组[0.32（0.20，0.46）×10-2比0.17（0.11，0.19）×10-2，0.56（0.30，0.76）×10-2比0.19（0.16，0.26）×10-2，0.26（0.16，0.33）×10-2比0.18（0.12，0.21）×10-2，0.29（0.19，0.37）×10-2比0.06（0.04，0.09）×10-2，1.14（0.81，1.86）比0.86（0.78，0.92），P均<0.05]，并且活动期患者高于缓解期患者[0.45（0.31，0.53）×10-2比0.16（0.13，0.20）×10-2，0.73（0.56，0.78）×10-2比0.26（0.21，0.33）×10-2，0.26（0.24，0.35）×10-2比0.17（0.14，0.26）×10-2，0.35（0.28，0.38）×10-2比0.16（0.11，0.20）×10-2，1.77（0.90，2.07）比82.84（64.12，112.67），P均<0.05]。UC患者结肠组织中VDR表达水平显著低于对照组[0.66（0.28，19.15）×10-2比2.94（2.61，3.21）×10-2，P<0.001]，并且活动期患者低于缓解期患者[0.37（0.26，0.69）×10-2比2.63（1.78，3.24）×10-2，P<0.001]。线性回归分析发现UC患者结肠组织中RORγt/Foxp3比值与VDR表达水平成独立负相关（β = -0.530，P = 0.003）。
UC患者结肠组织中VDR表达降低与Th17/Treg细胞失衡相关。
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维生素D能调节体内免疫和炎症反应[1]，与溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）、系统性红斑狼疮等自身免疫性疾病以及结核病、代谢综合征等发病机制相关[2,3,4]。本课题组前期研究发现汉族UC患者中普遍存在维生素D不足，并且其受体（vitamin D receptor，VDR）基因多态性与UC易感性密切相关[5]，但其确切机制仍不清楚。近年来研究发现包括Th17细胞和调节性T细胞（regulatory T cells，Treg）在内的CD4+ T细胞亚群均表达VDR及维生素D代谢关键酶，并且可能是VDR信号调控机体免疫功能的重要靶点。其中Th17细胞主要表达RORγt，分泌白介素（interleukin，IL）-17、IL-22、IL-23等促炎因子，而Treg细胞以Foxp3表达为特征，能分泌IL-10等抑炎因子发挥其免疫调节功能。肠黏膜中Th17/Treg细胞之间的比例失衡可能参与UC发生发展。因此，本研究拟在UC患者结肠组织中检测VDR、Th17和Treg细胞相关因子的表达水平，分析结肠VDR表达与Th17、Treg细胞数量和比值（RORγt/Foxp3）的关系，其结果将为明确VDR信号在UC发病机制中的作用提供理论依据。
回顾性收集2018年6月至2019年6月于温州医科大学附属第二医院消化内科门诊或住院确诊的UC患者30例，纳入标准：依据"炎症性肠病诊断与治疗的共识意见（2018年，北京）[6]"确诊为UC。排除标准：（1）近半年内有维生素D相关制品及钙剂服用史；（2）合并其他自身免疫性疾病。
按照年龄、性别相匹配的原则选取2018年6月至2019年6月来我科行肠息肉摘除的住院患者15例作为对照组。纳入标准：（1）经结肠镜检查确诊为结肠息肉；（2）病理提示为腺瘤；（3）年龄>18岁。排除标准：（1）病理提示癌变；（2）合并感染性肠炎、缺血性肠病等其他肠道疾病；（3）合并严重皮肤病、心脑血管疾病、内分泌疾病、感染性疾病、自身免疫性疾病等；（4）合并严重肝肾功能不全；（5）近半年内有维生素D相关制品及钙剂服用史。所有入选对象均签署知情同意书，本研究取得本院伦理委员会批准（批准文号：2016科研课题第42号）。
收集研究对象年龄、性别、体质指数（body mass index，BMI）、吸烟情况、维生素D相关制品及钙剂服用史等临床资料，收集血清25-羟维生素D[25-hydroxyvitamin D，25（OH）D]浓度。根据改良Mayo评分系统将UC患者分为缓解期和活动期。分析比较UC患者和对照组结肠组织VDR、RORγt、Foxp3、IL-17及IL-10的表达水平。
研究对象的血标本于肠镜当天采集，静置30 min后离心分离获得血清，放入-80℃冰箱冻存，以便后续25（OH）D检测。结合既往检测经验及试剂盒说明书，采用电化学发光法检测血清25（OH）D水平，试剂盒购于德国Roche Diagnostics GmbH公司[5]。
取UC患者病变最为明显肠段的结肠组织；取肠息肉患者息肉以外的正常肠组织作为对照。根据结肠组织取材部位，以2∶1比例收集病例组和对照组的肠组织标本。
兔抗VDR抗体（Cell Signaling Technology公司，美国）、兔抗RORγt抗体（Affinity Biosciences公司，美国）、鼠抗Foxp3抗体（Abcam公司，英国）、鼠抗IL-17抗体（Santa Cruz Biotechnology公司，美国）、鼠抗IL-10抗体（Santa Cruz Biotechnology公司，美国）。
组织标本用4%多聚甲醛固定保存，石蜡包埋，5 μm切片，常规二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化，枸橼酸抗原修复液95℃ 40 min，3 %过氧化氢孵育25 min以去除内源性过氧化物酶活性，5%山羊血清封闭后滴加上述一抗，4℃过夜，同时以PBS代替一抗作阴性对照，PBS冲洗切片3次，滴加对应二抗（Biosharp公司，中国）于组织上，37℃孵育50 min，PBS洗涤后二氨基联苯胺（DAB）显色，苏木精复染后二甲苯脱水，最后中性树胶封片，镜检。
每张切片随机挑选至少3个200倍视野进行拍照。拍照时尽量让组织充满整个视野，保证每张照片的背景光一致。应用Image-Pro Plus 6.0软件选取相同的棕色或棕黄色作为判断所有照片阳性的统一标准，对每张照片进行分析得出阳性的累积吸光值（A）以及组织的像素面积（area），最后求出平均光密度值A/area（mean density）。
所有数据均经SPSS 18.0软件进行统计分析。计数资料以频数（%）表示，采用卡方检验或Fisher精准检验进行组间比较。正态分布的计量资料以（Mean ±SD）表示，偏态分布的计量资料以M（P25，P75）表示，采用K-S单样本检验分析数据是否呈正态分布。正态分布结果采用两独立样本t检验进行组间均值比较，偏态分布结果采用秩和检验（Mann-WhitneyU）。在线性回归前将不符合正态分布的因变量经对数转换后，再行K-S单样本检验以确定其符合正态分布。再将所有自变量经对数转换后，采用线性回归（逐步法）分析UC患者结肠组织中RORγt/Foxp3比值与VDR表达水平的关系，并通过Durbin-Waston进行独立性检验。P<0.05认为差异有统计学意义。
30例UC患者中，男性16例（53.33%），女性14例（46.67%），年龄（31.97±4.66）岁，病程（1.55±0.41）年；中位Mayo评分（范围）为5（1 ~ 8），根据改良Mayo评分将UC患者分为缓解期10例（33.33%）和活动期20例（66.67%），活动期组中，轻度活动11例（36.67%），中度活动7例（23.33%），重度活动2例（6.67%）。使用柳氮磺吡啶或5-氨基水杨酸、糖皮质激素、抗生素、免疫抑制剂和英夫利西单克隆抗体治疗分别有24例（80.00%）、11例（36.67%）、15例（50.00%）、1例（3.33%）和3例（10.00%），行结肠切除术1例（3.33%）。
15例对照者中，男性6例（40.00%），女性9例（60.00%），年龄（31.53 ± 3.93）岁。UC组和对照组在年龄和性别构成比上差异均无统计学意义（P均>0.05）。但UC患者BMI、吸烟比例及血清25（OH）D水平均显著低于对照组，见表1。
UC患者及对照组一般临床资料
UC患者及对照组一般临床资料
| 组别 | 例数 | 男性[例（%）] | 年龄（岁，Mean ± SD） | 体质指数（kg/m2，Mean ± SD） | 吸烟情况[例（%）] | 血清25（OH）D水平（Mean ± SD） | ||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 正在吸烟 | 已戒烟 | 从不吸烟 | ||||||
| UC组 | 30 | 16（53.33） | 31.97±4.66 | 20.27±1.86 | 2（6.67） | 8（26.67） | 20（66.66） | 18.27±7.03 |
| 对照组 | 15 | 6（40.00） | 31.53±3.93 | 22.93±2.71 | 5（33.33） | 5（33.33） | 5（33.33） | 30.87±4.61 |
| 统计值 | 0.711 | 0.309 | 3.297 | 6.725 | 6.282 | |||
| P值 | 0.399 | 0.759 | 0.003 | 0.035 | <0.001 | |||
注：UC为溃疡性结肠炎；25（OH）D为25羟-维生素D
Th17和Treg细胞相关转录因子（RORγt、Foxp3）均为胞核表达，细胞因子（IL-17、IL-10）均在胞质中表达，见图1。与对照组相比，UC患者结肠组织中RORγt、Foxp3、IL-17、IL-10的表达强度均明显增高（P均<0.05），且活动期高于缓解期（P均<0.05）。采用RORγt/Foxp3比值来表示结肠组织中Th17/Treg细胞比例，结果显示，UC患者结肠组织中RORγt/Foxp3比值明显高于对照组（P均<0.05），且活动期明显高于缓解期（P均<0.05），见表2、表3。
UC组和对照组结肠组织Th17和Treg细胞相关转录因子和细胞因子的蛋白表达水平比较
UC组和对照组结肠组织Th17和Treg细胞相关转录因子和细胞因子的蛋白表达水平比较
| 组别 | 例数 | VDR（×10-2） | RORγt（×10-2） | IL-17（×10-2） | Foxp3（×10-2） | IL-10（×10-2） | RORγt/Foxp3比值 |
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| UC组 | 30 | 0.66（0.28，19.15） | 0.32（0.20，0.46） | 0.56（0.30，0.76） | 0.26（0.16，0.33） | 0.29（0.19，0.37） | 1.14（0.81，1.86） |
| 对照组 | 15 | 2.94（2.61，3.21） | 0.17（0.11，0.19） | 0.19（0.16，0.26） | 0.18（0.12，0.21） | 0.06（0.04，0.09） | 0.86（0.78，0.92） |
| 统计值 | -4.046 | -4.941 | -3.867 | -2.693 | -9.738 | -2.338 | |
| P值 | <0.001 | <0.001 | <0.001 | 0.010 | <0.001 | 0.019 |
注：UC为溃疡性结肠炎；VDR为维生素D受体；IL为白介素
UC活动期组和缓解期组结肠组织Th17和Treg细胞相关转录因子和细胞因子的蛋白表达水平比较
UC活动期组和缓解期组结肠组织Th17和Treg细胞相关转录因子和细胞因子的蛋白表达水平比较
| 组别 | 例数 | VDR（×10-2） | RORγt（×10-2） | IL-17（×10-2） | Foxp3（×10-2） | IL-10（×10-2） | RORγt/Foxp3比值 |
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| UC活动期 | 20 | 0.37（0.26，0.69） | 0.45（0.31，0.53） | 0.73（0.56，0.78） | 0.26（0.24，0.35） | 0.35（0.28，0.38） | 1.77（0.90，2.07） |
| UC缓解期 | 10 | 2.63（1.78，3.24） | 0.16（0.13，0.20） | 0.26（0.21，0.33） | 0.17（0.14，0.26） | 0.16（0.11，0.20） | 82.84（64.12，112.67） |
| 统计值 | -4.313 | -4.275 | -3.852 | -2.097 | -6.886 | -2.552 | |
| P值 | <0.001 | <0.001 | <0.001 | 0.036 | <0.001 | 0.011 |
注：UC为溃疡性结肠炎；VDR为维生素D受体；IL为白介素
VDR主要分布于结肠上皮层，为胞核表达，见图2。UC组结肠组织中VDR表达水平低于对照组，且活动期低于缓解期（P均<0.001），见表2，表3。
采用线性回归分析UC患者中影响结肠RORγt/Foxp3比值的相关因素，纳入的变量包括年龄、性别、吸烟情况以及VDR表达水平，结果显示UC患者结肠组织中RORγt/Foxp3比值与VDR表达水平成负相关（β = -0.530，P = 0.003），而与年龄、性别、吸烟情况无关（P均>0.05）。
大量研究表明，肠黏膜免疫异常激活是导致UC发生、发展和转归的重要机制。Th17和Treg细胞对UC发病机制的影响可能较Th2细胞更为重要。Th17细胞主要合成IL-17等炎性因子，通过增强靶细胞通透性、诱导炎性细胞募集和活化，最终促进炎症发生。研究均表明UC患者肠黏膜中Th17细胞数量及相关因子（RORγt、IL-17、IL-22、IL-23）的表达水平显著高于健康对照，并且与UC疾病活动度呈正相关[7,8]。Treg细胞主要表达Foxp3，能分泌IL-10等抑炎因子直接或间接抑制过度激活的免疫应答，缓解肠道炎症反应。本研究发现UC结肠组织中Foxp3和IL-10表达水平显著高于对照，并且活动期显著高于缓解期，与既往研究结果一致[9]。目前认为尽管UC患者结肠组织中Treg细胞数量高于健康对照，但与憩室炎、感染性肠炎等其它肠道炎性疾病比较，UC患者肠黏膜中Treg细胞的比例降低，提示UC患者中可能存在Treg细胞相对缺乏[10,11]。
作为肠道促炎-抑炎稳态的重要组分，Th17/Treg细胞平衡与UC的关系目前备受学术界重视。本研究采用RORγt/Foxp3比值来反应Th17/Treg细胞之间的比例关系，结果发现UC患者结肠组织中存在Th17/Treg细胞失衡。国内学者Geng等[12]发现UC患者外周血中Th17/Treg细胞比值明显高于对照组，与本研究结果一致。日本学者Fukaura等[7]报道，相对于Treg细胞相关因子，肠黏膜中Th17细胞相关因子（如IL-17A、IL-17F、IL-21）的基础表达水平可能是预测UC复发风险的重要指标。另有一项加拿大研究显示UC疾病活动度与结肠组织中Th1细胞数量呈负相关，而与Treg细胞数量无关[13]。肠黏膜CD4+ T细胞亚群失衡可能与UC慢性病程相关，但其确切关系有待于进一步研究。
本研究还发现UC患者结肠组织中VDR表达水平显著低于对照组，并且活动期低于缓解期。线性回归分析显示VDR表达水平降低与RORγt/Foxp3比值增加相关。理论上，CD4+ T细胞是VDR信号的重要靶点，其信号异常将影响T细胞的分化、增殖和凋亡。VDR信号可以调控Th1/Th2细胞极化，抑制Th17细胞的增殖和分化，减少IL-17等细胞因子的产生[14]。VDR信号还能直接上调Foxp3和CTLA-4的表达水平以促进Treg细胞增殖[15]。肠黏膜中VDR表达减少使Th17/Treg细胞比例失衡，进而加重肠道炎症反应。
综上所述，我们研究发现UC患者结肠组织中VDR表达降低，且与肠黏膜Th17/Treg细胞失衡相关。但由于本研究仅检测肠组织中VDR表达水平与Th17、Treg细胞相关因子表达的关系，而未能直接检测这两类细胞的绝对数目及比例，因此VDR表达与Th17/Treg细胞平衡的确切关系及潜在机制仍有待于后续研究进一步证实。
所有作者均声明不存在利益冲突
