先天性马蹄内翻足(congenital talipes equinovarus，CTEV)是儿童最常见的骨骼肌肉出生缺陷畸形之一，临床特征包括跟骨内翻、前足内收、高弓足和后足跖屈畸形^[1,2,3]。CTEV的发病机制目前仍不清楚，可能与神经细胞损伤、肌肉异常、血管缺陷、子宫内限制、遗传因素、特发性先天性畸形、基因－环境相互作用、骨骼发育不良、细胞外基质(extracellular matrix，ECM)异常、分子转运和代谢异常等因素有关^[4,5]。目前普遍认为，CTEV是由环境因素和遗传因素共同作用所致^{[3,6,7,8,9,10,11,12]}。研究发现，24%~50%的CTEV患儿有家族史^[7]。另外，Engell等^[13]在对CTEV双胞胎的研究中发现，单卵双胞胎患病概率一致性较异卵双胞胎更高(32%比2.9%)，证明遗传因素在CTEV的发生中可能发挥重要作用。分子生物学研究发现，在CTEV患儿的肌肉及韧带组织中有许多基因及蛋白表达与正常儿童不同，这也证实遗传因素的作用^[14]。总之，遗传因素对于CTEV的致病起着重要作用，但尚未发现主要的致病基因。本文对CTEV相关致病基因的研究进展进行综述，以期为CTEV的研究提供理论基础。

细胞凋亡是一个多基因严格控制的过程，相关基因包括B淋巴细胞瘤-2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)家族、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(cysteinyl aspartate specific proteinase，CASP)基因家族、抑癌基因p53等。细胞凋亡在生物体进化、内环境稳定以及多个系统发育中起着重要作用。CASP是半胱氨酸蛋白酶家族的一员，在细胞凋亡、坏死以及炎症中发挥作用^[15]。CTEV患儿的基因包括6个大的染色体缺失区域(2q31-33、3q23-24、4p16-14、7p22、13q33-34、18q22-23)和2个重复区域(6q21-27和10p15-11)。CASP8、CASP10与2q31-33区域的缺失相关，这些基因调控线粒体介导的凋亡通路，在肢体和肌肉发育中起着关键作用^[6]。Bacino等^[6]证实了CTEV与位于2q31-33上的两个短串联重复序列GATA149B10和D2S1371的缺失存在关联。此外，凋亡基因(CASP9、CASP10、CASP8、CASP3、凋亡酶激活因子1、Bcl-2)的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)参与线粒体介导的细胞凋亡，这些基因的变异可能与CTEV存在一定关联^[6,11]。Jiang等^[4]证明Bcl-2家族成员在细胞凋亡调控中发挥核心作用，细胞凋亡是通过外部或内在途径激活，由于Bcl-2相关X蛋白和Bcl-2之间的不平衡，激活内在通路而使线粒体膜通透性改变，使胎盘细胞凋亡，导致下肢血液供应不足和发育空间不足，从而诱发CTEV，胎盘细胞凋亡的不平衡可能对CTEV的发展起着重要的作用。

HOX基因是一个转录因子家族，在胚胎发育的形态发生过程中起着核心作用^[16]。HOX基因簇的50个成员，高度协调且有序介导着肢体发育。胚胎时期肢体肢芽的形成，就是在成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor，FGF)信号的影响下，以原始近端中胚层细胞内的HOX基因表达的方式开始。Wang^[17]证实了HOX基因在CTEV组织中高表达。此外，研究还发现CTEV组中iNOS、NO、IL-1β、IL-6、TNF-α、Fas、FasL和Bax mRNA表达明显高于对照组，表明CTEV组发生了严重的氧化损伤，其发病机制可能与炎症反应和细胞凋亡相关，具体机制还需更深入研究。

HOXA和HOXD基因参与肢体的肌肉、肌腱和软骨的同步发育，这两种基因突变会导致各种肢体畸形。Barker等^[18]发现HXOA和HOXD复合体通过骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)调控骨和关节的发育，在动物模型中BMP与生长分化因子(growth differentiation factor，GDF)协同作用引起肢体畸形。Ester等^[19]发现CTEV与HOXA、HOXC和HOXD基因组调控区域变异相关联，调控区突变增加了启动子活性。此外，HOXD10、HOXD12(rs847154)和HOXD13(rs13392701)可能是CTEV的关键易感基因^[7,11,20]。Wang等^[21]认为HOXD13基因的表达水平下降，使四个半LIM结构域蛋白1(four and a half LIM domains protein 1，FHL1)的表达水平下调，影响人胚胎期足的发育，导致CTEV。FHL1基因位于Xq36染色体上，CTEV患儿踇长屈肌中FHL1表达下调，与骨骼肌分化相关，导致异常骨骼肌形成^[22]。

LIM同源盒基因家族(LIM-homeobox gene，LHX)是HOX基因的亚家族之一，Yang等^[23]发现LIM同源盒基因家族的成员LHX9是性腺、四肢、心脏和神经系统等器官正常发育所必需的，LHX9作为FGF和音猬因子(sonic hedgehog，SHH)的整合体调节肢体发育，其位于脊椎动物肢芽后缘、是由SHH基因编码的分泌蛋白，是建立前肢和后肢极性的关键信号分子。

CTEV患儿在出生时即出现小腿肌肉发育不全，经过治疗后患侧小腿肌肉仍较正常缩小，提示编码肌肉发育的基因可能参与疾病的发生。Weymout等^[24]发现编码骨骼肌纤维的收缩蛋白基因(MYBPH、TPM2、TNNT3、TPM1、MYH13、MYH3)变异影响了肌纤维的收缩性，是CTEV的潜在候选基因。已经明确的肌肉收缩基因TPM1(rs4075583)，TPM2(rs2025126，rs2145925)和TNNC2均与CTEV有关^[6,10,24,25]。Weymouth等^[10]认为TPM2表达增加可能会导致肌肉萎缩，表现为小腿肌肉发育不全，这些重要肌肉功能的不平衡可以导致CTEV。Ester等^[19]认为作为候选基因的胰岛素样生长因子结合蛋白3 (insulin-like growth factor binding protein 3，IGFBP3)，其变异体在肢体和肌肉形态发生中发挥重要作用。

在CTEV患儿中可以观察到Ⅱ型肌肉的持续减少，在CTEV胚胎发育时可以观察到编码Ⅱ型肌肉成分的基因表达，包括肌凝蛋白2、肌凝蛋白3、肌凝蛋白7和肌凝蛋白8^[7]。Shyy等^[26]证实肌凝蛋白调节通路的缺陷或者与其相互作用的蛋白质可能作用于肌凝蛋白，从而导致CTEV，因此肌凝蛋白可以做为CTEV的一个重要、非直接的病因。另外，Racca等^[27]发现MYH3的表达局限于胎儿时期，但MYH3 mRNA和胚胎肌球蛋白存在于正常成人和胎儿的骨骼肌中。MYH3的突变可以影响胎儿时期和成人时期的骨骼肌收缩和舒张。Hwang等^[28]发现肌节同源盒基因1(muscle segment homeobox 1，MSX1)是肢体畸形的候选基因，MSX1表达区域和细胞凋亡相重叠，表明MSX1可以通过调节细胞凋亡程序在肢芽发育中发挥作用。这些基因的异常表达均可能增加CTEV的患病风险。

T-box基因家族4 (T-box gene family 4，TBX4)、配对样同源域1(paired-like homeodomain transcription factor 1，PITX1)和PITX1-TBX4的发育途径在CTEV发病中起一定作用^{[2,7,25,29,30,31]}。TBX基因编码转录因子参与肢体生长过程的调控^[11]。Yong等^[11]发现TBX3基因作为易感基因，其第3个等位基因短串联重复D12S378在CTEV患儿中存在传递不平衡。TBX4转录因子位于17q23.1-q23.2染色体区域，参与肢体肌肉和肌腱的形成，对正常的后肢发育至关重要。多个基因组研究表明家族性和散发性CTEV病例中存在这一区域的缺失和重复染色体^{[10,12,29,32]}。PITX1是一种参与早期肢体发育的转录因子，是少数在下肢优先表达的基因之一，对下肢的发育至关重要^[29]。PITX1突变可能导致小腿肌肉萎缩、胫腓骨体积缩小和胫前动脉畸形^[6]。TBX4是PITX1的下游转录靶点，PITX1通过对TBX4表达的调控来塑造后肢的形态^[29]。Gurnett等^[31]发现PITX1-TBX4通路在CTEV发病机制中发挥作用，位于PITX1基因高度保守的区域的一个错义突变(p.E130K)通过降低外显率的主导方式，在多代人的家族性CTEV中进行常染色体遗传^[30]。

COL家族基因中的COL9A1和COL1A1基因是CTEV相关遗传学研究的重点^[16]。COL9A1基因编码构成透明软骨的IX型胶原蛋白^[11]。CTEV患儿外展肌中COL9A1的表达明显高于对照组，提示COL9A1(rs35470562)基因可能是CTEV的重要易感基因^[24,33]。COL1A1编码I型胶原的前α1链，这是大多数结缔组织的一个成分，富含于骨和肌腱中^[16]。COL1A1基因在CTEV患儿中的mRNA表达水平明显高于健康人^[11]。研究表明，SRY-盒包含蛋白9 (sex determining region Y-box 9，SOX9)转录因子与COL2A1和COL9A1基因上游区域的序列对相结合，并调节其表达。在CTEV患儿的肌肉样本中，SOX9和COL9A1高表达存在相关性^[34]。

GLI3是参与早期肢体发育的重要转录因子之一，已证实其与指(趾)的发育密切相关，有学者以CTEV核心家系作为研究对象，通过SNP关联分析发现GLI3基因与CTEV的发生可能相关^[35]。Akiyama等^[36]发现，婆罗双树样基因4 (sal-like 4，SALL4)-GLI3体系在早期肢体骨骼发育中起关键作用。Cao等^[37]认为哺乳动物的GLI3基因家族编码的锌指转录因子在人类发育和疾病中起调控的作用，作为候选基因，GLI3表达水平的变化与CTEV的发生相关。Zhang等^[38]发现在染色体12q24.31(rs7969148)上基因间的两个转录调控因子锌指蛋白664 (zinc finger protein 664，ZNF664)和核受体共抑制因子2 (nuclear receptor corepressor 2，NCOR2)的变异与CTEV的发生相关。此外，HOXD13可以在肢体的形成中直接调节GLI3的表达，HOXD13表达减少会导致GLI3的表达增加，可能在CTEV发病机制中起关键作用。曹东华等^[35]证实了ENL基因通过调控GLI3基因的表达参与CTEV的发生，但CTEV的发生可能与多个基因相关，这些基因之间的相互作用有待深入研究。

孕母怀孕期间吸烟已确定是环境风险因素，参与烟草代谢的基因可能在出生缺陷中起作用，NAT2参与N-乙酰化作用下烟草的生物转化，在NAT2基因多态性中，导致与CTEV有关的乙酰化活动减少，表明芳香胺和具有潜在毒性作用的积累添加物的生物转化减少，可能与CTEV的发展相关。Hecht等^[39]发现CTEV患儿存在明显的缓慢NAT2乙酰化表型，提示乙酰化可能是CTEV的危险因素。Sommer等^[40]通过对8种烟草代谢酶基因的研究，证实异源性代谢基因NAT2之间存在相互作用，使得罹患CTEV的风险增加，孕妇吸烟和孕期异源性代谢基因的作用对胎儿发育的影响还有待研究。

RA信号在脊椎动物发育过程中起着核心作用，内源性RA通过抑制FGF8促进前肢发育^[41]。RA通过细胞毒性或增强细胞凋亡等作用来抑制软骨的发育。RA致畸机制可能是基于RA改变了细胞分化^[42]。增加RA的浓度，可增强转录因子激活蛋白-2 (activator protein-2，AP-2)的表达，并降低了软骨源性维甲酸敏感蛋白质(cartilage derived retinoic acid sensitive protein，CD-RAP)和Ⅱ型胶原蛋白的表达，从而抑制软骨发育^[42]。通过比较CD-RAP在CTEV和正常人外展拇趾肌中的表达水平，发现CD-RAP基因在CTEV患儿中高表达，提示CD-RAP可能是CTEV的易感基因^[11]。

通过给大鼠胃内注射RA可以建立大鼠胚胎CTEV模型，表现为后肢先天性畸形、软骨发生受损和细胞凋亡增加。通过调节p53/p21在软骨早期胚胎发育过程中的表达，使鼠后肢芽基质细胞(rat embryo hindlimb bud mesenchymal cells，rEHBMCs)中软骨特异性蛋白下调，从而抑制软骨的形成^[43]。RA也可以通过抑制SOX9和COL2Al等软骨特异性分子的表达，使PITX1的表达下调，抑制rEHBMCs的软骨发育，导致产生CTEV^[43]。

PITX1与沉默信息调节因子1 (sirtuin 1，SIRT1)的启动子结合可促进SIRT1的转录，SIRT1调控RA信号的激活，抑制PITX1的表达可以使肌腱细胞SIRT1基因转录下调并且激活RA信号通路，这可能是CTEV潜在的发病机制^[44]。孕17天是大鼠胚胎下肢晚期骨骼肌分化的一个关键时间点。在大鼠E17下肢中发现了控制骨骼肌发育和分化的基因表达出现峰值，包括PAX3、HGF、MYOD和MYOGENIN^[22]。总之，RA可能作用于多种基因和途径调控肢体的发育，具体的机制需要更多的临床样品和动物模型进一步验证。

在CTEV的研究中，服用叶酸的孕母分娩出CTEV患儿的发生率较未补充叶酸的孕母低^[45]。母亲基因型与孕期叶酸补充量之间的相互作用可能会影响CTEV的发病，提示叶酸代谢可能与CTEV相关。CTEV也与母体MTHFR基因多态性相关^[46]。MTHFR基因上677T变异的儿童具有较低的CTEV患病风险，但叶酸代谢复杂，叶酸途径在CTEV中的作用有待进一步研究^[45]。

FLNB是一种细胞骨架蛋白，它与肌动蛋白交联形成三维细胞骨架网络并维持细胞形态，在骨骼疾病中起关键作用。Yang等^[1]对一个三代家族性和53例散发性CTEV患儿进行了全外显子序列测定和Sanger测序，发现FLNB基因中的c.4717G>T(p.D1573Y)发生致病突变，提示FLNB可能参与CTEV发病。并在随后的体外实验证明M633V、Y732C、D1573Y突变可以影响FLNB蛋白的表达，在细胞质中诱导FLNB的局部积累，这三种新的FLNB错义突变与CTEV有关。

PDGF和TGF可以诱导组织损伤的愈合以及组织纤维化，可能导致CTEV的病理性挛缩^[2,25]。TGF-5信号调节细胞增殖、凋亡、分化、ECM形成和重塑等过程，还参与骨骼、血管和造血的动态平衡。生长分化因子5(growth differentiation factor-5，GDF5)是一种生长因子，与TGF-β家族中软骨来源的形态发生蛋白1(cartilage-derive morphogenetic protein 1，CDMP-1)在骨骼发育的几个关键时期表达^[47]。ECM为器官、组织和细胞膜提供结构支持，在细胞分化、增殖、存活和迁移中发挥作用。ECM整合有助于调节TGF-β受体信号^[47]。TGF-β受体信号也发挥了ECM在CTEV中的作用^[5]。

RBM10是RNA结合蛋白的一种，其表达和功能异常可导致多种疾病。有学者通过对CTEV基因组中错义突变及拷贝数变异的识别，发现了大量与CTEV相关的基因和通路，包括NACA2、RBM10等^[1]。RBM10的突变可以导致一种多器官发育异常遗传疾病--TARP综合征，表现为马蹄内翻足、房间隔缺损、皮罗序列征以及永存左上腔静脉^[6]。

WNT基因家族在细胞增殖、迁移、极性和细胞凋亡过程中起着重要作用， WNT7a可能是CTEV的候选基因。WNT7a在细胞命运、肢体发育中起作用，其突变可能影响脊椎动物背侧的发育，从而干扰肢体的正常轴发育。WNT7a和CAND2(在胚胎肢体形成时期的骨骼中高度表达)可增加CTEV的易感性，但不能直接产生CTEV^[20]。

FOXN3、SORCS1、MMP7、TMEM123基因与CTEV有关^[29,38]。FOXN3是一种叉头翼状螺旋形转录因子，在肢体发育中高度表达。SORCS1是分拣蛋白10的域内受体^[38]。TMEM123为前胀亡受体，是一种在肿瘤细胞凋亡和细胞粘附中起作用的跨膜蛋白质；而MMP7是一种无所不在的基质金属蛋白酶。TMEM123与MMP7都能够控制肢体发育，二者之间的SNPs可能与CTEV相关^[38]。

ROBO是一类与发育有关的保守的跨膜蛋白家族，调控轴突导向和细胞迁移。ROBO参与的发育信号通路启动了胚胎和器官的发育，任何环节的异常都可能导致畸形^[5]。

过氧化物酶体是一种在多种细胞和代谢途径中起重要作用的细胞器。GDAP1参与过氧化物酶体的分裂，PEX26突变可破坏过氧化物酶体基质蛋白的导入，使过氧化物酶体发生生物学紊乱，这两种突变的表型后遗症都包括内翻足^[47]。

综上所述，CTEV的病因学研究已经取得了重大进展，但主要的致病基因仍然未知。目前研究发现，CTEV的发生可能与多种致病基因相关，这些基因的上游和下游之间存在着广泛的调控，富集的信号通路之间也存在着广泛的相互作用。通过对CTEV患儿基因学的研究以及动物模型的实验，CTEV的发病机制的研究正在不断深入，这对CTEV的预防和诊断具有深远意义。