了解男性生殖道沙眼衣原体感染患者沙眼衣原体血清型分布及其主要外膜蛋白编码基因ompA基因变异情况。
收集2011年12月至2013年3月首都医科大学附属北京同仁医院泌尿门诊疑似生殖道沙眼衣原体感染的男性患者送检的生殖道分泌物标本399份，使用沙眼衣原体检测试剂盒进行初筛，将初筛阳性标本进行巢式PCR扩增其ompA基因并测序，测序产物使用BLAST比对分型，并使用MegAlign程序进行比对。
399份标本中检测出沙眼衣原体的标本有59份，沙眼衣原体检出阳性率为14.8%(59/399)。59份阳性标本均成功分型，其中E型17份(28.8%)，F型16份(27.1%)，D型13份(22.0%)，G型5份(8.5%)，H、K型各3份(5.1%)，J型2份(3.4%)；其中血清型D型临床株ompA基因突变最多(9株)，且多为有意义突变，其次为G型(5株)。
男性生殖道沙眼衣原体血清型以E、F、D型为主；其中血清型D型ompA基因变异最多。
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生殖道沙眼衣原体感染是一种以沙眼衣原体为致病菌的泌尿生殖系统疾病，主要通过性接触传染，临床上大约有50%的男性为无症状感染，常导致感染隐性传播并形成慢性持续性感染，同时还可发生严重的并发症及后遗症。因此早期正确诊断沙眼衣原体感染十分重要。
2011年12月至2013年3月首都医科大学附属北京同仁医院泌尿门诊疑似生殖道沙眼衣原体感染的男性患者送检的生殖道分泌物标本399份。患者均知情同意，方案经伦理委员会批准。
一次性男子专用拭子，1.5 ml EP管，沙眼衣原体核酸测定试剂盒(荧光PCR法)购自上海之江生物科技股份有限公司，MX3000P STRATAGEN荧光定量PCR仪，Bio-RAD MyCycler PCR扩增仪，DDW、MAKERⅠ、MAKERⅡ及2×EasyTaq PCR SuperMix购自北京全式金生物技术有限公司，PCR反应引物合成及目的片段测序由北京诺赛基因组研究中心有限公司完成。
使用碘伏消毒尿道外口，将一次性拭子伸入尿道口3～4 cm，顺时针旋转3～4圈，停留5～6 s，取出后放入取样试管中送检[1]。
在分泌物标本中加入1 ml无菌生理盐水，充分震荡混匀，将液体转移至1.5 ml EP管中，13 000 r/min离心5 min，离心半径＝9.35 cm，沉淀加1 ml无菌生理盐水震荡混匀，13 000 r/min离心5 min后弃上清，沉淀直接加入50 μl核酸提取液充分混匀，沸水浴10 min，再13 000 r/min离心5 min，取上清作为PCR模板，使用沙眼衣原体核酸测定试剂盒(荧光PCR法)对标本进行初筛。
将初筛得到的沙眼衣原体阳性标本进行巢式PCR，扩增其ompA基因。按照文献合成2对引物，外引物：5′GGACATCTTGTCTGGCTTTAACT3′，5′GCGCTCAAGTAGACCGATATAGTA3′，内引物：5′GTCCCGCCAGAAAAAGATAG3′，5′CCAGAAACACGGATAGTGTTATTA3′[2]。巢式PCR反应体系：50 μl，含DNA模板5 μl，DDW 17 μl，上、下游引物各1.5 μl，2×EasyTaq PCR SuperMix 25 μl。反应条件：95 ℃变性5 min，94 ℃ 30 s、52 ℃ 1 min、72 ℃ 1 min共35个循环，72 ℃延伸10 min。扩增产物取10 μl于1%琼脂糖凝胶(含溴化乙锭0.6 μl/L)进行电泳，在紫外线灯下观察结果。
将巢式PCR扩增后的沙眼衣原体阳性标本产物进行基因测序。测序引物如下，5′ATAGCGAGCACAAAGAGAGC3′，5′ACCACTTGGTGTGACGCTATCCAG3′，5′TGGGATCGTTTTGATGTATT3′，5′ACGTTAGGAGCTTCTTTCCAATA3′，5′TCCTTACATTGGAGTTAAATGGTC3′ [2]。将测序产物使用PubMed上的BLAST进行比对。
A，A/Har-1，DQ064279；B，B/TW-5，DQ064281；Ba，Ba/Apache-2，DQ064282；C，C/TW-3，DQ064283；D，D/UW-3，DQ064284；E，E/Bour，DQ064286；F，F/IC-CAL3，DQ064287；G，G/392，DQ064288；H，H/580，DQ064289；I，I/UW-12，DQ064290；Ia，Ia/870，DQ064291；J，J/UW-36，DQ064292；K，K/UW-31，DQ064293；L1，L/440，DQ064294；L2，L2/434，DQ064295；L3，L3/404，DQ064296。
测序产物使用PubMed中的BLAST进行血清分型，并使用DNAstar 5.0软件中的MegAlign程序对临床株沙眼衣原体ompA基因测序结果与各血清型沙眼衣原体标准序列进行比对，分析其ompA基因的变异情况。
2011年12月至2013年3月共收集疑似生殖道沙眼衣原体感染的男性生殖道分泌物标本399份，就诊患者平均年龄为32.7岁。检测出沙眼衣原体阳性标本59份，患者平均年龄为31.7岁。检出阳性率为14.8%。
59份沙眼衣原体阳性标本均成功分型。其中E型17份(28.8%)，F型16份(27.1%)，D型13份(22.0%)，G型5份(8.5%)，H型、K型各3份(5.1%)，J型2份(3.4%)。未发现沙眼衣原体血清变异型及混合血清型感染。
与相应的血清型参考序列进行比对后发现，血清型D型临床株存在基因突变最多，共9株；其次5株G型血清临床株中均存在1～2个突变点，而17株E型血清型临床株中仅有1株存在基因突变，16株F型血清型中有2株存在基因突变，血清型J与K中各有1株临床株存在1个基因突变点，血清型H未见基因突变，临床株基因序列与参考序列一致(表1)。
临床标本沙眼衣原体ompA基因变异情况
临床标本沙眼衣原体ompA基因变异情况
| 血清型 | 突变标本数量 | 基因突变位点 | 核酸变异 | 意义 |
|---|---|---|---|---|
| D | 1 | 132 | C→T | 无意义突变 |
| 2 | 154 | G→A | 丙氨酸→苏氨酸 | |
| 2 | 184 | G→A | 缬氨酸→甲硫氨酸 | |
| 2 | 186 | T→G | 无意义突变 | |
| 2 | 195 | C→T | 无意义突变 | |
| 2 | 223 | A→G | 赖氨酸→谷氨酸 | |
| 2 | 228 | T→A | 无意义突变 | |
| 2 | 246 | T→C | 无意义突变 | |
| 2 | 249 | G→C | 谷氨酰胺→组氨酸 | |
| 1 | 485 | A→G | 天冬酰胺→丝氨酸 | |
| 2 | 636 | A→T | 无意义突变 | |
| 1 | 991 | A→G | 苏氨酸→丙氨酸 | |
| 1 | 994 | G→A | 甘氨酸→丝氨酸 | |
| 7 | 976 | G→A | 丙氨酸→苏氨酸 | |
| 1 | 1029 | C→T | 天冬氨酸→天冬酰胺 | |
| E | 1 | 1096 | G→A | 缬氨酸→异亮氨酸 |
| F | 1 | 310 | G→A | 精氨酸→赖氨酸 |
| 2 | 352 | G→A | 精氨酸→赖氨酸 | |
| G | 2 | 352 | G→A | 精氨酸→赖氨酸 |
| 5 | 1003 | G→T | 精氨酸→亮氨酸 | |
| J | 1 | 369 | C→T | 无意义突变 |
| K | 1 | 1044 | T→C | 无意义突变 |
近年来，由于北美和欧洲等地区通过国家和地区性的性传播疾病控制项目，使既往高发病率的性传播疾病——淋病和梅毒得到一定范围的控制，但是生殖道沙眼衣原体感染的患病率和发病率却不断上升[3,4,5]，有报道显示，在世界各国报道的性传播疾病中，沙眼衣原体感染的发病率与患病率最高，而且在发达国家，衣原体的筛查备受重视。我国于2006年也将生殖道沙眼衣原体感染从非淋菌性尿道炎中独立出来，可见其重要性。
2012年有研究对澳大利亚近5年来生殖道沙眼衣原体的感染情况进行系统性回顾及荟萃分析发现，沙眼衣原体感染在不同人群中发病率不同，其中在青年人群发病率最高，达14.6%[4]。同样在其他国家不同城市不同人群中，生殖道沙眼衣原体感染的阳性率也不同[3,4,5]。本研究结果表明我院就诊的患者中生殖道沙眼衣原体感染阳性率为14.8%，处于中上游水平。而深圳市对性传播疾病诊所就诊的患者进行生殖道沙眼衣原体感染调查研究发现，生殖道沙眼衣原体阳性率为17.7%[6]，高于我院患者发病率。
本研究显示在生殖道沙眼衣原体感染的男性患者中沙眼衣原体血清型以E、F、D型为主，与我国大部分地区筛查得到的血清分型结果一致[6,7,8]。在非洲生殖道沙眼衣原体感染血清型以G、D、F型为主[9]，澳大利亚以D、G、J型为主[10]，而我国广西以F、G、E型为主，海南以F、E、G型为主[8]。可见在不同国家不同地区不同人群中生殖道沙眼衣原体感染的血清型分布情况也有一定的差异。
本研究对临床株沙眼衣原体ompA基因测序发现，血清型D型及G型存在碱基变异最多，而血清型E、F、J、K和H型ompA基因高度保守。但有报道显示在我国广州主要以血清型K型碱基变异最多，其次为血清型G型、E型[11]。陈丽丽等[12]报道显示血清型E、F型基因高度保守，与本研究结果一致。而在瑞典，最常见的碱基变异血清型为D型，其次为E型[13]。
虽然我国目前还没有对生殖道沙眼衣原体感染进行全国大范围内的流行病学调查，但也有研究表明我国的生殖道沙眼衣原体感染病例在逐年上升。因此，对生殖道沙眼衣原体感染的筛查极为重要。而对沙眼衣原体ompA基因进行测序分析可以进一步了解沙眼衣原体的流行病学资料及其变异情况，为研究沙眼衣原体的致病机制及疫苗研发提供临床资料。
