探讨c–Jun激活区结合蛋白1(Jab1)在结直肠癌发生发展中的作用及其与结直肠癌临床病理特征的关系。
回顾性收集嘉兴市第一医院2007年1月至2008年12月行手术切除的80例结直肠癌组织标本，采用免疫组织化学EnVision二步法检测结直肠癌及其相应癌旁正常组织中Jab1的表达情况并分析其与临床病理特征的关系；提取6例新鲜结直肠癌手术标本的总蛋白并进行定量，通过蛋白质印迹检测结直肠癌组织与癌旁正常组织中Jab1的表达。
免疫组织化学及蛋白质印迹结果均显示，Jab1在结直肠癌组织中的表达显著高于在癌旁正常组织中的表达，结直肠癌组织中Jab1阳性表达率为96.3%(77/80)，高表达者66例(82.5%)，低表达者14例(17.5%)；而癌旁组织中Jab1阳性表达率为8.8%(7/80)，与结直肠癌组织之间差异有统计学意义(P<0.05)；Jab1阳性表达与肿瘤细胞分化程度、浸润深度、TNM分期和淋巴结转移情况有关(均P<0.05)；Jab1阳性表达与增殖指标Ki–67表达呈显著正相关(r＝0.548，P<0.01)，与p27kip1表达呈显著负相关(r＝–0.461，P<0.01)。
Jab1异常表达可能参与了结直肠癌的发生发展并与p27kip1负相关。Jab1有望成为评价结直肠癌恶性程度和判断预后的重要参考指标。
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结直肠癌(colorectal carcinoma，CRC)是常见的恶性肿瘤之一，发病率逐年上升，在欧洲已经位于第2位，在美国位于第3位，在我国其发病率也不断上升，病死率已高居前3位[1,2]。细胞周期素依赖性激酶抑制蛋白p27kip1(简称p27)是重要的细胞周期负性调控因子，其蛋白水平的表达及亚细胞分布的改变与肿瘤的发生发展有关[3,4]。c–Jun激活区结合蛋白1(c–Jun activation domain–binding protein 1，Jab1)，是激活蛋白1(activator protein–1，AP–1)的辅助因子，也是COP9信号复合物的第5个组分(CSN5)，其参与细胞周期的调控[5]。现通过检测结直肠癌中Jab1蛋白的表达，探讨其表达与结直肠癌临床病理特征的关系，以及在结直肠癌预后评价中的意义。
收集嘉兴市第一医院2007年1月至2008年12月行手术治疗并经病理检查证实为结直肠癌的标本80例，以及距肿瘤边缘5 cm以上的癌旁正常组织。所有患者临床及病理资料完整，其中男52例、女28例；年龄31～82岁，平均63.7岁；肿瘤大小：1.5～10.0 cm，平均4.6 cm；肿瘤部位：左半结肠19例，右半结肠26例，直肠35例；浸润深度：T1组2例，T2组8例，T3组70例；淋巴结转移：转移组(N1)32例，无转移组(N0)48例；大体类型：隆起型28例，溃疡型39例，浸润型13例；组织学类型：中分化腺癌62例，低分化腺癌13例，黏液腺癌5例；根据美国癌症联合会(AJCC)第7版结直肠癌TNM分期标准：Ⅰ期8例，Ⅱ期39例，Ⅲ期31例，Ⅳ期2例。所有患者术前均未接受过任何放化疗或其他辅助治疗。另收集结直肠癌手术切除的6对新鲜结直肠癌组织及癌旁正常组织用于蛋白提取。本研究经嘉兴市第一医院伦理委员会同意批准，并获得患者或其家属的知情同意。
兔抗人p27多克隆抗体(C–19，美国Santa Cruz公司)；小鼠抗人Jab1单克隆抗体(611618，美国BD公司)；小鼠抗人Ki–67单克隆抗体(MIB–1，福州迈新生物技术有限公司)；辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔IgG、HRP标记的山羊抗小鼠IgG和β–肌动蛋白单抗(美国Sigma公司)；增强化学发光(ECL)试剂(美国Pierce公司)；免疫组织化学检测试剂盒(k5007，丹麦Dako公司)。
6对新鲜结直肠癌及癌旁组织用2×十二烷基硫酸钠(SDS)匀浆缓冲液裂解提取蛋白，紫外分光法测定蛋白浓度。取等量蛋白进行SDS–聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)电泳，湿转法将凝胶上蛋白转移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，室温封闭(含10%脱脂奶粉的TBST)2 h。一抗(p27，1∶800；Jab1，1∶500；β–肌动蛋白，1∶2 000)分别室温孵育1 h，4 ℃孵育过夜。HRP耦联的二抗(1∶1 000)室温孵育2 h，ECL显色。Bio–Rad Quantity软件分析测定其区带的吸光度，β–肌动蛋白为内参对照，用目的蛋白与β–肌动蛋白的吸光度(A)比值表示蛋白表达水平。
按试剂盒说明，采用EnVision二步法，磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗作为阴性对照。结果判定：Ki–67以细胞核出现棕黄色或棕褐色颗粒为阳性；Jab1和p27以细胞核或胞核伴胞质出现棕黄色颗粒为阳性，只有胞质出现棕黄色颗粒为非特异性染色。每张切片选取5个有代表性的高倍视野(400×)，每个视野计数300个肿瘤细胞，计算阳性细胞百分率。阳性细胞<10%为–；10%～30%为＋；>30%～60%为＋＋；>60%为＋＋＋。–和＋归为低表达，＋＋和＋＋＋归为高表达。
应用SPSS 16.0统计软件，符合正态分布的计量资料用
±s表示，计数资料用例(%)表示。采用χ2检验、Fisher精确概率法和Pearson相关分析法分析Jab1和p27表达与结直肠癌临床病理特征的关系；采用Spearman等级相关分析法分析Jab1和p27表达之间的相互关系。P<0.05为差异有统计学意义。
蛋白质印迹结果显示，Jab1在6对结直肠癌组织中的表达均明显高于对应癌旁组织(0.061 2比0.020 6, 0.057 2比0.020 4, 0.111 4比0.040 8，0.102 0比0.051 0, 0.142 9比0.064 2, 0.122 4比0.039 8)；而p27在癌组织中的表达明显低于对应癌旁组织(图1)。免疫组织化学染色结果显示，Jab1主要定位于细胞核，呈棕黄色颗粒状，胞质偶有少量表达。癌旁组织中Jab1表达不明显或不表达，而结直肠癌组织中表达较高(图2A)。p27在细胞核或细胞质染成棕黄色或棕褐色颗粒，癌旁组织中高表达，且主要定位于胞核，癌组织中表达相对较低，在胞质和胞核中呈弥漫分布(图2B)。结直肠癌组织中Jab1阳性表达率为96.3%(77/80)，高表达者66例(82.5%)，低表达者14例(17.5%)，而癌旁组织中Jab1阳性表达率仅为8.8%(7/80)，与结直肠癌组织比较，差异有统计学意义(P<0.05)。
1～ 6．分别为6对标本，T：结直肠癌组织，N：癌旁正常组织
Jab1在结直肠癌组织中的表达与患者年龄、性别、肿瘤大小、部位等均无关(均P>0.05)，而与肿瘤细胞分化程度、浸润深度、TNM分期和淋巴结转移情况差异均有统计学意义(P＝0.013、0.003、0.001、0.001)(表1)。
Jab1表达与结直肠癌临床病理特征的关系[例(%)]
Jab1表达与结直肠癌临床病理特征的关系[例(%)]
| 临床病理特征 | 例数 | 高表达 | 低表达 | χ2值 | P值 | |
|---|---|---|---|---|---|---|
| 性别 | 3.010 | 0.390 | ||||
| 男 | 52 | 42(80.8) | 10(19.2) | |||
| 女 | 28 | 24(85.7) | 4(14.3) | |||
| 年龄(岁) | 2.706 | 0.439 | ||||
| ≥60 | 55 | 47(85.5) | 8(14.5) | |||
| <60 | 25 | 19(76.0) | 6(24.0) | |||
| 肿瘤大小(cm) | 3.931 | 0.269 | ||||
| ≥5 | 42 | 38(90.5) | 4(9.5) | |||
| <5 | 38 | 28(73.7) | 10(26.3) | |||
| 肿瘤部位 | 8.344 | 0.214 | ||||
| 左半结肠 | 19 | 16(84.2) | 3(15.8) | |||
| 右半结肠 | 26 | 22(84.6) | 4(15.4) | |||
| 直肠 | 35 | 28(80.0) | 7(20.0) | |||
| 大体类型 | 1.387 | 0.967 | ||||
| 隆起型 | 28 | 23(82.1) | 5(17.9) | |||
| 溃疡型 | 39 | 31(79.5) | 8(20.5) | |||
| 浸润型 | 13 | 12(92.3) | 1(7.7) | |||
| 组织学类型 | 5.262 | 0.109 | ||||
| 中分化腺癌 | 62 | 48(77.4) | 14(22.6) | |||
| 低分化腺癌 | 13 | 12(92.3) | 1(7.7) | |||
| 黏液腺癌 | 5 | 5(100.0) | 0(0) | |||
| 分化程度 | 4.670 | 0.013 | ||||
| 中分化 | 63 | 49(77.8) | 14(22.2) | |||
| 低分化 | 17 | 16(94.1) | 2(5.9) | |||
| 浸润深度 | 10.251 | 0.003 | ||||
| T1 | 2 | 2(100.0) | 0(0) | |||
| T2 | 8 | 4(50.0) | 4(50.0) | |||
| T3 | 70 | 61(87.1) | 9(12.9) | |||
| 淋巴结转移 | 6.813 | 0.001 | ||||
| N0 | 48 | 34(70.8) | 14(29.2) | |||
| N1 | 32 | 31(96.9) | 1(3.1) | |||
| TNM分期 | 10.264 | 0.001 | ||||
| Ⅰ期 | 8 | 2(25.0) | 6(75.0) | |||
| Ⅱ期 | 39 | 31(79.5) | 8(20.5) | |||
| Ⅲ期 | 31 | 30(96.8) | 1(3.2) | |||
| Ⅳ期 | 2 | 2(100.0) | 0(0) | |||
| 远处转移 | 4.439 | 0.218 | ||||
| 阴性 | 77 | 63(81.8) | 14(18.2) | |||
| 阳性 | 3 | 3(100.0) | 0(0) | |||
| 脉管侵犯 | 4.579 | 0.205 | ||||
| 阴性 | 72 | 58(80.6) | 14(19.4) | |||
| 阳性 | 8 | 8(100.0) | 0(0) | |||
| 神经侵犯 | 1.081 | 0.782 | ||||
| 阴性 | 77 | 63(81.8) | 14(18.2) | |||
| 阳性 | 3 | 3(100.0) | 0(0) | |||
结直肠癌组织中Jab1与增殖指标Ki–67表达呈正相关(r＝0.548，P<0.01)，与p27表达呈负相关(r＝–0.461，P<0.01)。
大量研究资料表明结直肠癌的发生发展与细胞周期失控密切相关。p27是一种广谱的细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂，它可通过影响细胞周期素依赖性蛋白激酶复合体(cyclin–CDK)的活性，抑制细胞的增殖和分裂，从而抑制肿瘤的发生发展。Jab1能够与多种蛋白相互作用，是一种重要的信号转导分子，参与细胞周期调控、信号转导、转录激活、蛋白稳定性及降解等调控[6]。据文献报道，Jab1可以特异性地与p27结合，使其通过泛素–蛋白酶体途径降解[7]。因此，在结直肠癌中研究Jab1的表达以及与p27的相关性十分必要。
已有研究显示，Jab1在多种恶性肿瘤如鼻咽癌、卵巢癌、胰腺癌等中呈高表达[8,9,10]，其相应的正常组织和良性分化组织呈低表达，说明Jabl过表达与肿瘤的发生发展密切相关。本研究Jab1在结直肠癌组织中的表达明显高于癌旁正常组织，与上述文献报道相似，提示Jab1高表达可能参与结直肠癌的发生。Wang等[11]报道Jab1在食管鳞状细胞癌的发生发展过程中起重要作用，并且与患者的预后密切相关。本研究结合结直肠癌患者的临床病理资料分析发现，Jab1蛋白表达与结直肠癌的分化程度、浸润深度、TNM分期和淋巴结转移情况有关，这些临床病理指标都是与患者预后密切相关的重要因素。远处转移和血管、神经侵犯分组均与患者预后无关，其原因可能如下：远处转移在大多数情况下需结合临床相关检查，病理科所接收标本难以体现；恶性肿瘤生长过程中，一方面是肿瘤新生血管形成，另一方面是肿瘤侵犯、破坏瘤内新生血管，形成瘤内血管癌栓，但在本组病例中可能有些浸润癌栓较微小，由于手术或取材的原因，在所观察的病理切片中镜下未查见，但实际是存在的，而且一旦查见，即确定有侵犯；可能由于入选阳性病例样本量较少。因此，这些结果提示Jab1蛋白表达上调是结直肠癌的重要恶性表型特征之一，与结直肠癌的恶性进展有关，其高表达提示患者可能预后不良。但还需要进一步扩大标本量，对结直肠癌患者长期随访，并进行生存分析来进一步证实。
Hsu等[12]研究发现乳腺癌中Jab1与p27表达呈显著负相关，且与乳腺癌的不良预后有关。本研究显示，结直肠癌组织中Jab1与增殖指标Ki–67表达呈显著正相关，与p27表达呈负相关，提示Jab1和p27共同参与了结直肠癌的发生发展，并且与肿瘤细胞的异常增殖有关。研究表明，p27主要在细胞核内发挥作用，其胞质胞核定位与其功能活性密切相关[13]。本研究显示，p27在癌旁正常组织胞核中高表达，癌组织中表达相对较低，且在胞质和胞核弥漫分布，这证实了上述观点，提示在结直肠癌组织中p27蛋白分布的异常调控可使细胞周期失控、肿瘤形成。上述结果表明在结直肠癌组织中，Jab1表达异常增加时，可加速p27的出核转运以及继发的泛素化降解，导致结直肠癌细胞内p27蛋白水平下降，引发细胞周期调控紊乱，从而参与结直肠癌的发生发展。然而，对于p27出核降解的具体机制尚未明了，在这条途径中，Jab1究竟如何发挥作用尚有待进一步研究。
综上所述，Jab1的异常表达可能在结直肠癌的发生发展过程中发挥着重要作用。Jab1可能通过与p27结合来介导p27的核内外分布并影响其表达，进而影响p27的功能状态，参与调控结直肠癌细胞的生长。Jab1有望成为评价结直肠癌恶性程度和判断预后的重要参考指标，为结直肠癌的基因治疗提供新的可能途径。
