探讨核酸适配子AS1411对紫杉醇耐药肺腺癌A549细胞(A549/T细胞)凋亡的影响。
采用0～20.0 μmol/L浓度的AS1411处理A549/T细胞，甲基甲苯基硫细胞检测(MTS)实验、平板克隆形成实验检测细胞活性[吸光度值(A490 nm)]及增殖能力变化，流式细胞仪检测对细胞凋亡的影响，同时应用蛋白免疫印迹法检测凋亡信号通路相关蛋白表达的变化。
A549/T细胞呈现部分上皮细胞间质化(EMT)、表皮生长因子受体(EGFR)表达缺失等特征。经5.0 μmol/L的AS1411处理后，与对照序列相比，A549/T细胞的细胞活性显著降低(A490 nm：0.185±0.009比0.272±0.006，P<0.001)、克隆形成数显著减少(74±13比120±12，P＝0.010)；随AS1411浓度的增加，细胞活性明显降低，呈剂量依赖性。用20.0 μmol/L的AS1411处理48 h后，A549/T细胞凋亡率显著高于对照序列[(19.9±2.6)%比(8.8±1.3)%，P＝0.002]，同时蛋白激酶B(AKT)、细胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)和B细胞淋巴瘤因子2(Bcl–2)表达均显著低于对照序列处理组(0.353±0.003、0.432±0.015、0.294±0.015比0.688±0.003、0.911±0.019、0.422±0.018，均P<0.001)。
AS1411可通过抑制AKT–ERK通路而促进A549/T细胞凋亡。
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根据世界卫生组织(WHO)最新统计，肺癌为人类最常见的恶性肿瘤，占肿瘤死亡总数的19.4%，每年新增病例数占总癌症新增病例的12.9%[1]。紫杉醇为肺癌常用的化疗药物之一，但是化疗耐药一直是导致其治疗失败的主要原因，也是目前治疗的难点[2]。寻找能够识别并且杀伤紫杉醇耐药细胞的药物十分具有临床意义。研究表明核仁素蛋白在多种肿瘤中广泛高表达并在肿瘤发生发展过程中起重要作用[3,4]。核酸适配子AS1411为人工合成能够与核仁素结合的单链DNA序列，通过影响核仁素信号传递、促进核仁素降解、抑制癌症相关部分的微RNA形成进而诱导肿瘤细胞凋亡[5,6]，现已进入血液肿瘤临床实验研究阶段[7,8]。本实验探讨AS1411对紫杉醇耐药肺腺癌A549细胞(A549/T)凋亡的影响及可能的信号通路。
A549/T细胞购自南京凯基生物科技发展有限公司。紫杉醇注射液(北京协和药厂)；甲基甲苯基硫细胞检测试剂(MTS)(美国Promega公司)；E–钙黏连蛋白、N–钙黏连蛋白、波形蛋白、β–肌动蛋白抗体(美国Santa–Cruz公司)；蛋白激酶B(AKT)、细胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)、B细胞淋巴瘤因子2(Bcl–2)、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Caspase–3)、β–连环蛋白、表皮生长因子受体(EGFR)、多聚ADP–核糖聚合酶剪切体(PARP)抗体(美国CST公司)；细胞凋亡检测试剂盒(北京欣博盛生物公司)；cDNA反转录试剂盒(美国Invitrogen公司)；CO2培养箱(日本SANYO公司)；多功能酶标仪(美国BIO–RAD公司)；倒置显微镜(日本Olympus公司)。AS1411及其对照序列由上海生工生物工程有限公司进行合成，AS1411序列为5' GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG 3'，对照序列为与AS1411碱基数相同的随机序列。分别用无菌生理盐水配制成浓度为500 μmol/L的储存液，–20 ℃冰箱保存，使用时直接用培养液稀释。
A549细胞培养条件为RPMI 1640培养液添加10%胎牛血清，A549/T细胞培养条件为RPMI 1640培养液添加10%胎牛血清和200 μg/L紫杉醇，37 ℃，5% CO2孵箱中培养。
取对数生长期A549与A549/T细胞，用0.25%胰酶消化后制成单细胞悬液，细胞计数，调整细胞悬液浓度至2×104个/ml，接种于96孔板，每孔100 μl。培养24、48、72、96 h。弃去培养上清后加入含10%MTS的RPMI 1640培养液孵育1 h。酶标仪测定490 nm波长处吸光度值(A490 nm)，参比波长为630 nm，重复实验3次。
培养收集A549细胞和A549/T细胞，裂解获取总蛋白，采用Western印迹法分别检测β–连环蛋白、波形蛋白、E–钙黏连蛋白、N–钙黏连蛋白、EGFR蛋白的蛋白表达水平。以与β–肌动蛋白内参的光密度比值作为蛋白的相对表达量。
采用体外反转录PCR扩增法检测目的基因表达。合成A549及A549/T细胞的cDNA，采用特异性引物对目的基因进行PCR扩增，特异性引物如下：β–肌动蛋白上游5′ CCACCATGTACCCTGGCATT 3′，下游5′ CGGACTCGTCATACTCCTGC 3′；转化生长因子(TGF)–β1上游：5′ GGGAAATTGAGGGCTTTCGC 3′，下游：5′ CCGTTGATGTCCACTTGCAGTG 3′；TGF–β受体1上游：5′ CGGGGAGAAGAAGTTGCTGTTG 3′，下游：5′ AATCTCTGCCTCACGGAACC 3′；血管内皮生长因子(VEGF)–A上游：5′ CTTGCCTTGCTGCTCTACCT 3′，下游：5′ GCAGTAGCTGCGCTGATAGA 3′；VEGF受体1(VEGFR–1)上游：5′ TGTCATCGTTTCCAGACCCG 3′，下游：5′ AAGTCACACCTTGCTTCGGA 3′；表皮生长因子(EGF)上游：5′ TTGATGAGTGCCAACTGGGG 3′，下游：5′ GTGAGGGGGTGGAGTAGAGT 3′；EGFR上游：5′ AAACCGGACTGAAGGAGCTG 3′，下游：5′ CCACTGGATGCTCTCCACAT 3′。将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，紫外分析拍照仪获取图像，以与β–肌动蛋白内参的光密度比值作为RNA相对表达量。
96孔板每孔接种3×103个A549/T细胞培养24 h后，弃上清，加入AS1411终浓度为0、2.5、5.0、10.0、20.0 μmol/L的RPMI 1640培养液，用含等浓度的对照序列的培养液孵育细胞作为对照组。48 h后弃去培养上清，加入含10% MTS的RPMI 1640培养液孵育1 h，酶标仪检测A490 nm值，参比波长为630 nm，重复实验3次。
根据细胞毒实验的结果，从中选取差异较为明显、对照序列毒性较小的序列浓度进行克隆形成实验。取对数生长期A549/T细胞，胰酶消化后调整细胞浓度至3×103个/ml，取100 μl加入到3 ml含AS1411或对照序列培养液的六孔板中，静置培养一周至细胞长出肉眼可见的单克隆，期间换液一次保证AS1411的作用浓度。弃培养上清，甲醇固定，结晶紫染色10 min后洗净，对克隆数进行统计。
A549/T细胞用20.0 μmol/L的AS1411及对照序列处理48 h后，倒置显微镜进行拍照，观察细胞的形态变化。同时胰酶消化收集细胞，预冷磷酸盐缓冲液(PBS)洗3遍，细胞计数，取50×104个细胞加入195 μl稀释好的结合缓冲液，加入5 μl异硫氰酸荧光素标膜联蛋白V(Annexin–V–FITC)混匀避光15 min。加入10 μl碘化丙啶溶液(PI)避光作用5 min，补加300 μl预冷结合缓冲液上机，同时以只加Annexin V–FITC和只加PI的一管作为阴性对照，对凋亡细胞的比例进行统计分析。
A549/T细胞用20.0 μmol/L的AS1411及对照序列处理48 h后，收集细胞，裂解获取蛋白。采用Western印迹法检测PARP、Caspase–3及ERK1/2、AKT、Bcl–2蛋白水平。以与β–肌动蛋白内参的光密度比值作为蛋白的相对表达量。
使用SPSS 16.0软件进行统计学处理，符合正态分布的计量资料用
±s表示，组间比较采用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。
A549细胞在加紫杉醇的培养条件下生长速率显著低于不加紫杉醇的培养条件；而A549/T细胞在两种培养条件下生长速率差异均无统计学意义(表1)。
A549与A549/T细胞的生长速度特性(A490 nm值，
±s，n＝3)
A549与A549/T细胞的生长速度特性(A490 nm值，±s，n＝3)
| 细胞及时间 | 未加紫杉醇 | 加紫杉醇 | t值 | P值 | |
|---|---|---|---|---|---|
| A549 | |||||
| 0 h | 0.121±0.003 | 0.120±0.002 | 0.510 | 0.621 | |
| 24 h | 0.184±0.005 | 0.141±0.005 | 15.912 | <0.001 | |
| 48 h | 0.497±0.013 | 0.244±0.011 | 37.887 | <0.001 | |
| 72 h | 0.728±0.043 | 0.247±0.022 | 22.383 | <0.001 | |
| 96 h | 0.982±0.053 | 0.267±0.015 | 31.704 | <0.001 | |
| A549/T | |||||
| 0 h | 0.081±0.001 | 0.080±0.001 | 1.464 | 1.740 | |
| 24 h | 0.160±0.004 | 0.154±0.004 | 2.368 | 0.039 | |
| 48 h | 0.363±0.022 | 0.357±0.005 | 0.562 | 0.582 | |
| 72 h | 0.529±0.063 | 0.462±0.018 | 0.149 | 0.825 | |
| 96 h | 0.918±0.064 | 0.873±0.031 | 0.666 | 0.520 | |
注：A549/T：紫杉醇耐药肺腺癌A549细胞(下同)
与A549细胞相比A549/T细胞表现部分上皮细胞间质化的分子特征，N–钙黏连蛋白显著高表达；同时EGFR蛋白在A549/T细胞中表达缺失(表2)。
A549、A549/T细胞上皮细胞间质化相关蛋白和部分酪氨酸激酶受体的相对表达(
±s，n＝3)
A549、A549/T细胞上皮细胞间质化相关蛋白和部分酪氨酸激酶受体的相对表达(±s，n＝3)
| 指标 | A549 | A549/T | t值 | P值 |
|---|---|---|---|---|
| β–连环蛋白 | 0.568±0.055 | 0.115±0.009 | 14.036 | <0.001 |
| 波形蛋白 | 0.471±0.046 | 0.156±0.010 | 11.524 | <0.001 |
| E–钙黏连蛋白 | 0.652±0.049 | 0.666±0.008 | 0.346 | 0.737 |
| N–钙黏连蛋白 | 0.007±0.003 | 0.345±0.035 | 17.351 | <0.001 |
| EGFR蛋白 | 0.890±0.131 | 0.008±0.003 | 11.705 | <0.001 |
| EGFR mRNA | 0.807±0.031 | – | 44.309 | <0.001 |
| EGF mRNA | 0.257±0.024 | – | 18.929 | <0.001 |
| VEGF–A mRNA | 0.377±0.015 | 0.396±0.012 | 1.197 | 0.297 |
| VEGFR–1 mRNA | 0.181±0.016 | – | 19.480 | <0.001 |
| TGF–β1 mRNA | 0.693±0.029 | – | 42.343 | <0.001 |
| TGF–β受体1 mRNA | 0.719±0.111 | 0.832±0.066 | 1.519 | 0.203 |
注：EGFR：表皮生长因子受体；EGF：表皮生长因子；VEGF–A：血管内皮生长因子A；VEGFR：血管内皮生长因子受体；TGF：转化生长因子。"–"代表在紫外分析仪上未检测到相应条带，计为P<0.001
与肺癌密切相关的部分酪氨酸激酶受体及其配体的表达受抑制，预示肺癌治疗中常用的酪氨酸激酶抑制剂对A549/T细胞无效(表2)。
在2.5 μmol/L浓度下AS1411即可抑制A549/T细胞的活性，随AS1411浓度增加，细胞活性下降比例增加，呈剂量依赖效应(表3)。在5.0 μmol/L浓度下AS1411作用明显，同时对照序列的毒性较小，在此浓度条件下进行的克隆形成实验结果显示AS1411可降低A549/T细胞的克隆形成能力，AS1411处理组克隆数显著低于对照序列处理组(74±13比120±12，t＝4.641，P＝0.010)。
不同浓度AS1411对A549/T细胞活性的影响(A490 nm值，
±s，n＝3)
不同浓度AS1411对A549/T细胞活性的影响(A490 nm值，±s，n＝3)
| AS1411浓度(μmol/L) | 对照序列 | AS1411序列 | t值 | P值 |
|---|---|---|---|---|
| 0 | 0.281±0.004 | 0.281±0.004 | 0.000 | 1.000 |
| 2.5 | 0.273±0.007 | 0.230±0.008 | 7.000 | <0.001 |
| 5.0 | 0.272±0.006 | 0.185±0.009 | 16.686 | <0.001 |
| 10.0 | 0.259±0.009 | 0.160±0.007 | 18.311 | <0.001 |
| 20.0 | 0.245±0.009 | 0.116±0.005 | 26.941 | <0.001 |
A549/T细胞在20.0 μmol/L的AS1411处理48 h后，光镜下细胞明显变圆皱缩，而对照序列处理组细胞形态无此变化(图1)。AS1411处理组细胞凋亡比例显著高于对照序列处理组[(19.9±2.6)%比(8.8±1.3)%，t＝6.770，P＝0.002]。
经20.0 μmol/L的AS1411及对照序列处理48 h后，与A549/T细胞凋亡程度相关的PARP剪切体表达量、剪切体Caspase–3表达量占总Caspase–3表达量百分比均显著高于对照序列处理组[(1.150±0.050)比(0.540±0.037)、(68.7±2.5)%比(44.1±2.1)%，t＝16.904、18.509，均P<0.001]。同时AS1411处理组AKT、ERK1/2、Bcl– 2蛋白水平均显著低于对照序列处理组(0.353±0.003、0.432±0.015、0.294±0.015比0.688±0.003、0.911±0.019、0.422±0.018，t＝29.111、34.268、10.922，均P<0.001)(图2)。
紫杉醇因在肺癌治疗上具有良好的疗效而广泛使用，但是肿瘤细胞对紫杉醇产生耐药是治疗失败的重要原因[9]。寻找能抑制紫杉醇耐药细胞的方法成为基础和临床研究的热点。本研究采用核酸适配子AS1411处理A549/T细胞后，细胞的活性与克隆形成能力都受到抑制，同时细胞凋亡数目增加，提示AS1411可通过诱导凋亡对A549/T细胞起到抑制作用。
肿瘤细胞膜上的核仁素蛋白是AS1411与癌细胞的结合靶点，而在正常的细胞中核仁素是没有膜定位的，这也是AS1411特异性杀伤肿瘤细胞的分子基础，但是至今科学家还没有完全揭示AS1411的作用机制。AS1411对多种肿瘤细胞都有非常好的抑制作用，同时对正常细胞毒性很小。因具备亲和力强、特异性高、制备廉价高效快速、高稳定性、尺寸小、易于修饰、免疫原性小、渗透性好、与目标靶分子的结合特异且条件可控等优势，AS1411成为一种十分具有前景的抗肿瘤药物。Soundararajan等[10]发现在人乳腺癌细胞系MCF–7中，AS1411可以干扰Bcl–2基因的mRNA与核仁素的结合，增加Bcl–2 mRNA的不稳定性进而起到抑制细胞生长的作用。目前临床上AS1411作为复发型急性骨髓性白血病治疗药物的2期临床实验已取得令人鼓舞的初步结果，同时AS1411治疗肾细胞癌的2期临床试验也已经展开[11]。本实验结果显示AS1411可降低A549/T细胞的Bcl–2蛋白水平，这与既往文献报道结果相符合[10]。同时本研究显示A549/T细胞在用AS1411处理后AKT、ERK1/2的蛋白水平同样下调，但具体机制还有待进一步研究。
本实验结果还显示A549细胞在对紫杉醇产生耐药后，N–钙黏连蛋白的表达显著上调，细胞显示出上皮细胞间质化的特征，但是波形蛋白和β–连环蛋白的表达却下降，这与经典的上皮细胞间质化有所不同。同时细胞自身EGFR及其配体EGF表达缺失、VEGFR–1和TGF–β1的激酶活性同样一定程度上受到抑制。EGFR是目前肺癌临床治疗中重要的靶向治疗靶标，EGFR的表达缺失会使得细胞对吉非替尼类激酶抑制剂变得不敏感，这提示我们在临床上对紫杉醇已经产生化疗耐药的肺癌患者不宜接受吉非替尼类药物的治疗，也对解释临床上一部分化疗耐药或者无法忍受后期化疗患者并不能从吉非替尼治疗中受益的现象具有一定启示[12,13]。本研究将AS1411应用到肿瘤化疗耐药的研究中，拓宽了AS1411的应用范围，为解决临床上紫杉醇耐药的问题提供了新的参考依据。
