了解类风湿关节炎(RA)患者滑膜肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF6)表达及其与血清骨代谢标志物的相关性。
2010年4月至2012年12月在中山大学孙逸仙纪念医院采用电化学发光法检测51例确诊RA患者和102例健康对照者的血清骨代谢标志物I型前胶原氨基端前肽(PINP)、骨钙素降解产物(N-MID.OC)和I型胶原C末端肽(CTX-I)的水平并分析其与临床疾病活动指标的相关性。免疫组化染色检测30例活动期RA患者滑膜TRAF6表达，评估TRAF6＋细胞数并分析其与骨代谢标志物之间的相关性。
RA患者血清CTX-I水平明显高于健康对照组[(0.53±0.33)×10–3比(0.33±0.16)×10–3g/L，P<0.01]。RA患者血清PINP和N-MID.OC与晨僵时间、健康评估问卷HAQ评分、疼痛VAS评分呈负相关(P<0.05)。RA患者血清PINP与双手平均握力呈正相关(r＝0.296, P<0.05)。RA滑膜衬里层和衬里下层均见TRAF6表达，且TRAF6表达在重度滑膜炎组高于轻度滑膜炎组。RA患者滑膜组织TRAF6表达与PINP和N-MID.OC呈正相关(r＝0.381，0.345, P<0.05)。
RA患者存在骨吸收增加、骨代谢失衡，其滑膜TRAF6表达增加可能与RA代偿性骨形成增加有关，TRAF6可能通过介导滑膜炎症参与了RA的骨代谢失衡。
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类风湿关节炎(RA)是一种常见的以进行性关节破坏为特征的慢性炎症性自身免疫病，最终可导致关节畸形和功能丧失[1]。骨保护素(OPG)与核因子(NF)-κB激活受体配体(RANKL)的比例失衡可致破骨细胞异常活化、骨质重建、新骨形成和骨质重吸收失衡[2]，使活动性RA患者外周血循环中骨代谢指标水平发生改变。骨代谢指标与RA病情活动及关节破坏相关，并可预测关节放射性进展及评估药物疗效[3]。肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF6)，参与破骨细胞的分化、存活及骨重吸收等过程[4]。TRAF6通过介导炎症反应参与RA滑膜炎症和关节骨破坏[5]。本研究拟探讨RA患者滑膜组织TRAF6表达与血清骨代谢标志物相关性。
2010年4月至2012年12月中山大学孙逸仙纪念医院风湿免疫科住院RA患者51例，诊断符合1987年美国风湿病学会(ACR)或2010年ACR/欧洲抗风湿联盟(EULAR)修订的RA分类标准。同时选择102例年龄和性别匹配的健康体检者作为健康对照组。所有患者和健康体检者均签署知情同意书并经孙逸仙纪念医院伦理委员会批准。
所有RA患者收集性别、年龄、发病年龄、病程等一般资料以及各项临床滑膜炎指标，包括28个关节压痛数及肿胀数、晨僵时间、双手握力、关节功能分级、疼痛视觉模拟评分(VAS)(0～10 cm视觉模拟尺度法)、健康评估问卷(HAQ)评分、关节炎影响指数(AIMS，0～10 cm视觉模拟尺度法，分患者自评和医生评估)、血红细胞沉降率(ESR)、C反应蛋白(CRP)、抗环瓜氨酸肽抗体(抗CCP)、类风湿因子(RF)、葡萄糖-6-磷酸异构酶(GPI)及28个关节疾病活动度评分(DAS28)-CRP。DAS28-CRP>2.6为病情活动。双手X线片采用改良Sharp评分法评估关节的Sharp总分以及关节侵蚀Sharp评分和关节狭窄Sharp评分。
采用电化学发光法检测血清骨代谢标志物，包括骨形成标志物I型前胶原氨基端前肽(PINP)和骨钙素(OC)降解产物N-MID.OC，以及骨吸收标志物I型胶原C末端肽(CTX-I)。检测原理为双抗体夹心法。采用罗氏诊断产品公司PINP、N-MID.OC和CTX-I检测试剂盒按照说明书进行操作，在罗氏Cobas e601电化学发光仪上进行检测。
上述RA患者中30例活动期RA患者同时行膝关节细针滑膜活检术[6]获取滑膜组织，离体后立即以10%甲醛固定，常规脱水、石蜡包埋、连续切片行HE染色及免疫组化(IHC)染色(LSAB法[5])。兔抗人TRAF6单抗(英国Abcam公司)以1∶50浓度稀释后进行染色，以PBS代替一抗作为阴性对照。以辣根过氧化物酶标记的抗兔/小鼠Envision多聚物(美国Dako公司)为二抗孵育后行DAB (3，3-联苯胺)-H2O2显色液显色，以阳性产物呈棕色而背景不着色为最佳，苏木精染核。TRAF6阳性细胞按滑膜整体、衬里层和衬里下层分别进行半定量评分：0分：无，1分：1%～25%，2分：26%～50%，3分：51%～75%，4分：76%～100%[5]。病理滑膜炎采用Krenn's滑膜炎积分[7]进行评定。
采用SPSS 13.0统计软件。数据描述采用
±s，计量资料两组样本比较先使用单样本K-S拟合优度检验判断数据是否为正态分布，正态分布使用t检验，非正态分布则使用Mann-Wittney U检验。两变量间相关程度与方向采用Spearman秩相关。均为双侧检验，以P<0.05为差异有统计学意义。
51例RA患者中女45例(88.2%)，男6例(11.8%)；年龄20 ～81岁，平均(55±14)岁；病程3 ～480个月，中位病程36个月；45例(88.2%)患者RF阳性，37例(72.5%)抗CCP阳性；47例(92.2%)DAS28-CRP>2.6，DAS28-CRP平均值5.5±1.6。双手X线示RA患者出现不同程度关节破坏，关节侵蚀Sharp评分17.9±21.5，关节狭窄Sharp评分14.0±18.8，Sharp总分31.8±39.3。6例(11.8%)从未接受过糖皮质激素或任何改善病情抗风湿药(DMARD)治疗；2例(3.9%)到中山大学孙逸仙纪念医院诊治前单用糖皮质激素治疗；5例(9.8%)单用或联用DMARD治疗，如甲氨蝶呤、来氟米特、羟氯喹等；22例(43.1%)联用糖皮质激素和DMARDs治疗。16例(31.4%)接受过生物制剂抗肿瘤坏死因子融合蛋白(益赛普)治疗。
RA患者血清骨吸收标志物CTX-I水平明显高于健康对照组[(0.53±0.33)×10–3比(0.33±0.16)×10–3g/L，P<0.01]，而骨形成标志物PINP和N-MID.OC在RA患者与健康对照组差异无统计学意义(P>0.05)(图1)。RA患者血清PINP、N-MID.OC和CTX-I水平在不同疾病活动度组间差异无统计学意义(P>0.05)。RA患者血清PINP和N-MID.OC与晨僵时间呈负相关(r＝–0.274和–0.281, P<0.05)，与健康评估问卷HAQ评分呈负相关(r＝–0.250和–0.353, P<0.05)，也与疼痛VAS评分呈负相关(r＝–0.341和–0.393, P<0.05)。RA患者血清PINP与双手平均握力呈正相关(r＝0.296, P<0.05)。RA患者血清CTX-I与血清GPI水平呈正相关(r＝0.619, P<0.01)。血清PINP、N-MID.OC和CTX-I水平与Sharp总分以及关节侵蚀Sharp评分和关节狭窄Sharp评分均无相关(均P>0.05)。RA非活动组和活动组血清PINP、N-MID.OC和CTX-I与上述疾病活动度指标之间均无相关关系(均P>0.05)。
30例RA膝关节滑膜病理示衬里层细胞不同程度增生，衬里层增生程度积分0.5±0.5(中位数1.0)，衬里下层炎症浸润程度积分1.3±0.5(中位数1.0)，基质活化程度积分1.5±0.6(中位数1.0)，总体Krenn's滑膜炎积分3.3±1.2(中位数3.0)。根据病理Krenn's滑膜炎积分，将30例RA分为轻度滑膜炎组(积分<4，n＝18)和重度滑膜炎组(积分≥4，n＝12)。血清骨形成标志物PINP和N-MID.OC水平在重度滑膜炎组高于轻度滑膜炎组(49.14±20.36比36.03±20.29 g/L；20.53±6.97比15.93±11.53 g/L，均P<0.05)，而血清骨吸收标志物CTX-I水平在重度与轻度滑膜炎组间差异无统计学意义(图2)。血清PINP、N-MID.OC和CTX-I水平与Krenn's滑膜炎积分及衬里层增生、衬里下层炎症浸润、基质活化程度均无相关关系(均P>0.05)。
IHC染色示RA滑膜衬里层和衬里下层均见TRAF6表达，主要表达在滑膜衬里层滑膜细胞和衬里下层浸润的炎症细胞如巨噬细胞、浆细胞、淋巴细胞。30例RA患者滑膜整体TRAF6评分2.6±0.7，衬里层TRAF6评分2.4±1.0，衬里下层TRAF6评分2.47±0.8。TRAF6表达在重度滑膜炎组高于轻度滑膜炎组(3.0±0.7比2.4±0.6，P<0.05)，衬里层和衬里下层TRAF6评分在重度滑膜炎组也高于轻度滑膜炎组(2.8±1.0比2.2±0.9，3.1±0.6比2.4±0.8，均P<0.05)。TRAF6在RA患者滑膜组织中的表达与血清PINP和N-MID.OC之间有明显正相关性(r＝0.381，0.345，均P<0.05)，但未发现滑膜组织中TRAF6表达与血清CTX-I有相关关系(P>0.05)。进一步将滑膜衬里层和衬里下层TRAF6进行分别评分和分析发现，衬里下层滑膜组织中TRAF6表达与血清PINP呈正相关(r＝0.353, P<0.05)，衬里层滑膜组织中TRAF6表达与血清N-MID.OC呈正相关(r＝0.407, P<0.05)，未发现衬里层和衬里下层滑膜组织TRAF6表达与血清CTX-I有相关关系(P>0.05)。
关节骨丢失和破坏的严重程度取决于破骨细胞的数量及功能[8]。TRAF6位于RANKL/RANK下游，诱导多条激酶通路激活，参与破骨细胞的分化、存活及骨的重吸收等过程[4]。本研究显示，RA滑膜衬里层和衬里下层均见TRAF6表达，主要表达在滑膜衬里层滑膜细胞和衬里下层浸润的炎症细胞。
RA患者存在破骨细胞异常活化、骨质重建、新骨形成和骨质重吸收失衡，使活动性RA患者外周血循环中骨代谢指标水平发生改变。骨代谢标志物是骨组织的代谢(分解与合成)产物，分为骨形成和骨吸收标志物。骨形成标志物代表成骨细胞活动及骨形成时的代谢产物，常用指标有OC降解产物N-MID.OC和PINP等，反映成骨细胞的活性和骨形成速率。骨吸收标志物代表破骨细胞活动及骨吸收时的代谢产物，特别是骨基质降解产物，常用的指标有血清及尿CTX-I等。其中PINP、N-MID.OC和血清CTX-I敏感性相对较好[3]。本研究发现，RA患者血清骨吸收标志物CTX-I水平明显高于健康对照者，而骨形成标志物PINP和N-MID.OC在RA患者和健康对照者之间差异无统计学意义，这与文献报道的一致[3]，并提示RA患者存在骨吸收增强。
Wislowska等[9]研究发现RA患者的血清CTX-I水平与关节肿胀数和疼痛数呈正相关。与非活动性RA及健康对照组相比，绝经前的活动性RA患者血清OC水平明显减低，尿胶原氨基末端肽(NTX-I)和尿尿脱氧吡啶诺林(D-Pyr)明显升高，提示活动性RA患者骨形成水平降低，骨吸收水平升高。Momohara等则发现，绝经后的活动性RA患者血清NTX-I水平与炎症活动度呈正相关，提示RA患者骨吸收水平与炎症活动相关。本研究发现，RA患者血清PINP和N-MID.OC与晨僵时间、疼痛VAS评分、HAQ评分呈负相关，而血清PINP与双手平均握力呈正相关；骨吸收标志物CTX-I与血清GPI水平呈正相关。这提示RA患者存在骨吸收和骨形成失衡，且与炎症活动相关，骨形成标志物PINP和N-MID.OC是否可作为早期判断RA疾病活动性的辅助指标值得进一步研究。
本研究表明，非活动性RA和活动性RA患者血清PINP、N-MID.OC和CTX-I与上述疾病活动度指标之间均无相关性，可能与每组患者例数较少有关。未发现血清PINP、N-MID.OC和CTX-I水平与Sharp总分以及关节侵蚀Sharp评分和关节狭窄Sharp评分之间有相关性，可能与例数较少有关。接受与未接受糖皮质激素治疗、接受与未接受DMARD治疗、接受与未接受生物制剂治疗RA滑膜TRAF6表达和血清骨代谢标志物水平，差异均无统计学意义，可能与未接受过上述治疗例数太少有关。
骨代谢异常是导致RA患者继发骨质疏松及局部关节破坏的主要原因，RA患者骨吸收增加。促炎因子激活在RA患者的骨质吸收中起关键作用。TRAF6是TNF受体家族和IL-1/Toll-like受体家族的主要信号传导子，可促进炎症因子TNFα、IL-1β和IL-6等的产生从而参与炎症反应。本研究发现，RA患者滑膜组织中TRAF6表达与血清PINP和N-MID.OC正相关，且衬里下层滑膜组织中TRAF6表达与血清PINP正相关，衬里层滑膜组织中TRAF6表达与血清N-MID.OC正相关，提示TRAF6可能参与了RA骨代谢失衡。RA患者破骨细胞活化和功能增强导致骨质吸收增加引起骨质疏松时骨钙化不足，成骨细胞反馈性增生活跃，成骨细胞不能转化为骨细胞，骨吸收亢进而出现代偿性骨形成增加。血清骨形成标志物PINP和N-MID.OC水平在重度滑膜炎组高于轻度滑膜炎组，提示滑膜炎症反应可使成骨细胞反馈性增生活跃，骨形成增加。RA患者滑膜组织中TRAF6表达重度滑膜炎患者高于轻度滑膜炎患者，与血清PINP和N-MID.OC正相关，提示TRAF6可能与代偿性骨形成增加有关，TRAF6可能通过介导滑膜炎症参与RA骨代谢失衡。
