观察转谷氨酰胺酶1基因(TGM1)表达沉默前、后对角质形成细胞的细胞周期及细胞周期相关蛋白表达的影响，探讨其机制。
利用流式细胞仪(FCM)检测RNA干扰(RNAi)技术沉默TGM1基因表达前、后人永生化角质形成细胞(HaCaT细胞)的细胞周期状况；应用免疫细胞化学SP法和Western印迹法检测RNAi技术沉默TGM1基因表达前、后细胞周期蛋白(cyclin)D1、cyclin B1、细胞周期蛋白依赖激酶4(CDK4)的表达差异。
TGM1基因沉默后，小干扰RNA(siRNA)-TGM1转染组处于G0/G1期的细胞数(78.27%±1.83%)明显高于阴性对照组(56.84%±2.72%，P<0.05)和空白对照组(57.19%±3.72%，P<0.05)；而S期和G2/M期的细胞数，siRNA-TGM1转染组(32.78%±5.48%、3.66%±0.30%)明显低于阴性对照组(57.32%±2.91%、9.39%±0.68%，均P<0.05)和空白对照组(55.71%±2.84%、9.77%±0.52%，均P<0.05)。免疫细胞化学检测结果显示，TGM1基因沉默后cyclinD1、cyclin B1、CDK4呈阴性表达；Western印迹法检测结果显示，TGM1沉默后cyclin D1、cyclin B1、CDK4的蛋白条带亮度明显降低。
TGM1基因沉默后能阻断HaCaT细胞的细胞周期，使细胞周期停留在S期，不能进入G2/M期，无法完成DNA的合成，未完成细胞的分裂；TGM1基因沉默可能通过抑制细胞周期相关蛋白cyclin D1、cyclin B1、CDK4的表达影响表皮细胞的细胞周期。
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研究发现转谷氨酰胺酶1基因(transglutaminase 1，TGM1)突变是板层状鱼鳞病(lamellar ichthyosis)的主要致病基因。但TGM1基因突变后对该基因的功能产生怎样的影响，对角质形成细胞的细胞周期的影响如何，目前尚不清楚。抑制基因表达是研究基因功能的重要方法，常用的是RNA干扰(RNA interference，RNAi)技术[1,2]。本课题组前期研究筛选出最有效抑制TGM1表达的小发夹RNA(shRNA)序列-1649shRNA，并成功构建了TGM1 shRNA重组慢病毒载体[3]。本研究以人皮肤永生化角质形成细胞(HaCaT)为观察对象，通过RNAi技术沉默表达TGM1基因，利用流式细胞仪(FCM)检测RNA干扰(RNAi)技术沉默TGM1基因后HaCaT细胞的细胞周期状况，以及免疫组化和Western印迹法检测TGM1基因沉默后细胞周期相关蛋白表达差异，以探讨TGM1基因表达在角质形成细胞增殖生长中的作用及TGM1与角质形成细胞的细胞周期进展的关系，为研究TGM1基因在LI发病机制中的作用打下基础。
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HaCaT细胞经细胞复苏后，加入含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液，37 ℃、5 % CO2培养箱内培养24～48 h，后换液继续培养，培养、换液的时间由细胞贴壁情况而定。细胞正常传2、3代后，取指数生长期的细胞进行实验。培养基为DMEM-高糖培养基添加10%胎牛血清。
取对数生长期细胞，按每孔1 000个细胞的量铺板到96孔板中，待细胞贴壁过夜后，加入不同浓度梯度的筛选抗生素，G418为100～1 000 μg/ml,嘌呤霉素为0.1～2.0 μg/ml。每个浓度设置6个复孔。加药培养1周后，显微镜下观察，500 μg/ml G418以上的孔中细胞全部死亡，0.2 μg/ml嘌呤霉素以上浓度的细胞全部死亡。因此HaCaT细胞的杀伤浓度确定为500 μg/ml G418和0.2 μg/ml嘌呤霉素。
HaCaT细胞以密度5×104个/孔接种到6孔板，充分混匀。置于37 ℃、5%CO2培养箱内培养过夜；第2天细胞融合度为60%，进行慢病毒感染。吸去细胞培养基，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗2遍，每孔加入1 ml无血清的DMEM高糖培养基，饥饿1 h后，按照病毒滴度加入病毒液进行感染，感染后4～6 h，每孔补加1 ml含20%胎牛血清的完全培养基。次日吸弃全部培养基，更换成新鲜配制的完全培养基。进行病毒感染后第2天，按照杀伤浓度加入筛选药物，压力筛选3～4周，至细胞在筛选浓度下不再死亡，此时每样收集1×106细胞，进行实时定量-PCR(q-PCR)检测。HaCaT细胞转染时按实验要求分组如下：空白对照组(仅加DMEM-高糖培养基)、阴性对照组(加入含Lipofectamine 2000的DMEM-高糖培养基和pLVX-IRES-Neo-载体)、TGM1-小干扰RNA(siRNA)转染组(加入含Lipofectamine 2000的DMEM-高糖培养基和针对TGM1基因的特异性siRNA-pLVX-shRNA1 TGM1)，参考文献[2]。
取正常培养的处于对数生长期的稳定株细胞，每个取样时间点收集1×106细胞；消化后，离心收集细胞，弃上清，用预冷PBS洗细胞2次，加入预冷70%乙醇，于4 ℃固定过夜；离心收集细胞，以1 ml的PBS洗细胞1次去除乙醇，加入500 μl PBS含50 μg/ml溴化丙锭(PI)、100 μg/ml RNA酶A(RNase A)、0.2% Triton X-100细胞裂解液，4 ℃避光孵育30 min；上流式细胞仪检测，结果用细胞周期拟和软件ModFit 2.0分析。实验重复3次，结果取平均值。
按SP试剂盒说明书操作。实验前1晚进行细胞滴片，次日放入丙酮内10 min固定细胞，H2O2阻断内源性过氧化物酶后，滴加正常非免疫动物血清封闭10 min，分别滴加抗-cyclin D1 (1∶1 000)、抗- cyclin B1 (1∶1 000)、抗-CDK4(1∶2 000)的一抗室温孵育1 h，分别滴加生物素标记的二抗IgG(稀释比例为1∶1 000)及链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶溶液室温孵育各10 min。上述各步骤之间均以PBS充分洗涤。最后滴加新鲜配置的DAB显色液，于室温显色5 min，以PBS洗涤终止反应，再经苏木精衬染，逐级乙醇脱水、二甲苯透明及中性树胶封片。用正常培养的HaCaT细胞作阳性对照，用PBS代替一抗作阴性对照。阳性信号主要定位于细胞质，呈黄色或棕黄色染色。以阳性细胞数百分率及染色程度综合判断各组细胞的抗-cyclin D1、抗- cyclin B1、抗-CDK4蛋白表达情况。实验重复3次，以验证结果的可靠性。
用4 ℃预冷的PBS洗净培养液，收集细胞，加入1 ml TRIzol溶液，吹打混匀，使细胞充分裂解，4 ℃静置10 min；10 000 g，4 ℃离心10 min；溶液分为上下两相，两相中间为蛋白膜。吸除上层液体，随后用吸头轻轻拨开蛋白膜，吸除下层液体，蛋白膜附着于离心管壁；室温10 min空气干燥沉淀，BCA法进行蛋白质定量。将提取好样品的50 μg蛋白溶液和上样缓冲液按2∶1混合，煮沸5 min使蛋白质变性；进行10%SDS-PAGE分离蛋白，80 V恒压50 min，120 V恒压电泳至溴酚蓝刚出胶底部止。低温条件下，100 V恒压下转移蛋白质2 h至硝酸纤维素膜上；TBST漂洗5 min，3次，5%脱脂奶粉溶液室温封闭1 h，TBST漂洗5 min，3次，分别加入抗-cyclin D1、抗- cyclin B1、抗-CDK4一抗和GAPDH一抗(稀释比例均为1∶1 000)4 ℃过夜，TBST漂洗5 min，3次，加入二抗IgG(稀释比例均是1∶1 000)，37 ℃孵育1 h。TBST漂洗5 min，3次，蒸馏水漂洗膜2 min，弃去液体。共洗3次。ECL显色，X胶片显影，观察结果。以GAPDH作内参照。实验重复3次，以验证结果的可靠性。
采用SPSS 13.0统计学软件进行数据分析。正态分布的计量资料用
±s表示，多组均数间的比较采用单因素方差分析。P<0.05认为差异有统计学意义。
TGM1基因沉默后，TGM1-siRNA转染组处于G0/G1期的细胞数明显高于阴性对照组和空白对照组(均P<0.05)，阴性对照组与空白对照组差异无统计学意义(P>0.05); S期的细胞数，TGM1-siRNA转染组明显低于阴性对照组和空白对照组(均P<0.05)，阴性对照组与空白对照组差异无统计学意义(P>0.05)；G2/M期的细胞数，TGM1-siRNA转染组明显低于阴性对照组和空白对照组(均P<0.05)，阴性对照组与空白对照组差异无统计学意义(P>0.05)(表1)。
各组细胞周期检测结果(%，
±s，n＝6)
各组细胞周期检测结果(%，±s，n＝6)
| 组别 | G0/G1 | S | G2/M |
|---|---|---|---|
| 空白对照组 | 57.19±3.72a | 55.71±2.84a | 9.77±0.52a |
| 阴性对照组 | 56.84±2.72a | 57.32±2.91a | 9.39±0.68a |
| TGM1-siRNA组 | 78.27±1.83 | 32.78±5.48 | 3.66±0.30 |
注：与TGM1-siRNA组比较，aP<0.05
空白对照组和阴性对照组中cyclin D1、cyclin B1、CDK4蛋白在HaCaT细胞的细胞质中均呈强阳性表达，阳性细胞数占95%～100%；而TGM1-siRNA转染组中cyclin D1、cyclin B1、CDK4蛋白呈弱阳性表达或阴性表达(图1)。
TGM1-siRNA转染组的HaCaT细胞中cyclin D1、cyclin B1、CDK4蛋白条带亮度明显低于空白对照组和阴性对照组(图2)。
板层状鱼鳞病是一种临床上以广泛的鳞屑和角化过度为特征的常染色体隐性遗传性皮肤病，其发病率约为1/30万。目前，国内外研究在237例板层状鱼鳞病患者发现115个TGM1基因突变位点[4,5,6,7]。人体细胞的正常生长依赖于细胞周期中各种调节因子的平衡调控，任何一种调控因子发生紊乱将导致细胞异常增殖。在细胞周期调控中，G1～S期之间调控点是细胞内外信号传递、整合汇集到细胞核对细胞的增殖进行调控的关键点。与之相关的cyclin D1、CDK4共同组成一条重要的细胞调节通道。cyclin D1在细胞周期中可与CDK4结合，促进细胞周期进程。研究表明cyclin D1是保证细胞顺利由G1期进入S期，促进细胞分裂增殖的关键周期蛋白之一。CDK4主要与cyclinD1结合作为细胞周期G1/S位点的正向调节因子，促进细胞的增殖[8]。CDK4的功能与P16和cyclin D1有关。P16和cyclin D1竞争性地与CDK4结合，产生两种不同的效应。P16与CDK4结合后使pRb去磷酸化产生抑制细胞生长的作用，而cyclin D1与CDK4结合后使pRb磷酸化产生促进细胞生长的作用[9]。cyclin D1蛋白通过与CDK4结合形成复合体，并激活CDK4促进下游的pRb蛋白的磷酸化，并使与pRb结合的E2F等转录子释放、活化，启动E2F下游的信号系统，促进细胞周期跨过关卡点，缩短细胞周期，导致细胞周期调节失控和细胞异常增殖[10,11]。本研究结果表明，当实验组TGM1基因表达沉默后，免疫组化和Western印迹检测结果显示实验组HaCaT细胞cyclin D1、cyclin B1、CDK4蛋白表达明显下降，空白对照组和阴性对照组无此改变，认为其机制可能为TGM1基因沉默可导致cyclin D1表达降低，而CKD4又是cyclin D1的下游分子，因此当TGM1基因表达下降时就可以间接导致CKD4基因和蛋白抑制。
cyclin B1蛋白在整个细胞周期中的表达呈时相性变化。在G1期，cyclin B1蛋白表达量极低，S期明显增加，在G2期达到最高。cyclin B1蛋白作为激酶CDC2的调节亚基，与CDC2形成活性复合物即细胞促分裂因子或M期促进因子，主要参与G2/M期转变的调节；另外它还通过磷酸化多个蛋白，调节它们的活性与分布，从而参与纺锤体的形成和染色体的分离。有研究已经证实，沉默膀胱肿瘤细胞的某个基因的表达后，可以抑制cyclin D1的表达，导致膀胱肿瘤细胞周期停滞在G0/G1期[12]。本研究结果显示RNA干扰组的G0/G1期细胞数目较空白组和阴性组增多明显，干扰组的S、G2/G1期细胞数目较空白组和阴性组明显减少，实验表明TGM1 siRNA能有效阻滞HaCaT细胞周期。本结果提示沉默表达TGM1基因可能通过下调cyclin D1和CDK4的表达，导致HaCaT细胞周期停滞在G0/G1期；下调cyclinB1的表达，降低cyclinB1/CDK1复合物的水平而阻滞HaCaT细胞于G2/M期。
