比较高危型人乳头瘤病毒( HR-HPV) E6/E7 mRNA与HR-HPV DNA检测(HC-2、Cervista)方法在宫颈病变中的诊断性能，探讨其在宫颈病变筛查中的作用及意义。
选取2011年10月至2012年12月就诊于解放军总医院妇产科172例妇女，分别做宫颈脱落细胞的液基细胞学检查(TCT)、HC-2、Cervista、HR-HPV E6/E7 mRNA检测，阴道镜检查及宫颈活体组织检查，以组织学证实的高级别宫颈上皮内瘤变(CIN )Ⅱ或更高(Ⅱ＋)为研究终点。
HR-HPV E6/E7 mRNA阳性率在未见上皮内病变或恶性(NILM)中为37.9%，在意义不明的非典型鳞状细胞(ASCUS)和低度鳞状上皮内病变(LSIL)中为67.9%(36/53)，在非典型鳞状细胞不能排除高度鳞状上皮内病变(ASC-H＋)中为88.5%(54/61)。HR-HPV E6/E7 mRNA阳性率在CIN Ⅰ –中为38.6%，在CIN Ⅱ～Ⅲ为77.4%，在SCC中为92.5%。在CIN Ⅱ＋人群中HR-HPV E6/E7 mRNA检测特异度明显高于HC-2、Cervista(61.4%和54.3%，55.7%，P<0.05)，并具有更高的阳性预测值(75.9%、74.8%及74.6%)。比较HR-HPV E6/E7 mRNA、HC-2和Cervista的ROC曲线，HR-HPV E6/E7 mRNA曲线下面积最大，诊断效能最佳。
HR-HPV E6/E7 mRNA检测在宫颈病变筛查中比HC-2和Cervista检测具有更高特异性，为预测宫颈病变进展及宫颈癌筛查分流提供了新思路。
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子宫颈癌是常见的导致妇女死亡的第4位恶性肿瘤[1]。高危型人乳头瘤病毒(HR-HPV)感染是子宫颈癌致病的必要因素[2]，HR-HPV的持续感染可通过上调HPV E6/E7肿瘤蛋白表达启动致癌过程，HPV E6/E7肿瘤蛋白的过度表达与宫颈病变进展的风险密切相关[3]。在宫颈上皮内瘤变(CIN)Ⅱ＋人群中HR-HPV DNA检测比巴氏细胞学检查的灵敏度高[4]，但对预测高级别CIN(Ⅱ＋以上)二者特异度都不高[5]，临床诊治工作迫切需要高特异度、灵敏度的宫颈癌筛查方法[6]，HR-HPV E6/E7mRNA检测便是研究热点之一。本研究比较了HR-HPV E6/E7 mRNA、HC-2、Cervista 3种检测方法在宫颈癌筛查中的诊断效能，现报道如下。
选取2011年10月至2012年12月间解放军总医院妇产科就诊的172例妇女，均进行宫颈脱落细胞的液基细胞学检查(TCT)，HC-2检测、Cervista和HR-HPV E6/E7 mRNA检测，采用同一TCT标本进行。所有患者均无急性生殖道炎症及其他妇科合并症。
(1) TCT检测：使用美国Hologic公司生产的ThinPrep全自动超薄液基细胞学检测系统，由专业妇科病理医师负责细胞学诊断，结果判定参照2001 Bethesda系统分类标准[7]。(2)杂交捕获方法(HC-2)检测：采用美国DIGENE公司生产的HC-2系统，定性检测宫颈样本中的13种HR-HPV(HPV 16，18，31，33，35，39，45，51，52，56，58，59和68)。(3)Cervista HPV DNA检测：使用Hologic公司提供的Cervista HPV试剂和设备，由美国FDA批准的定性的体外诊断方法，检测14种HR-HPV DNA(HPV 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66和68)。(4)HR-HPV E6/E7 mRNA检测：使用河南Kodia生物技术公司生产的Quanti Virus®HPV E6/E7mRNA诊断试剂盒，针对14种HR-HPV(HPV16，18，31，33，35，39，45，51，52，56，58，59，66和68)检测。(5)病理学检查：阴道镜检异常者行宫颈活体组织病理学检查，病理学结果由2位专业的病理专家进行诊断。诊断标准参照世界卫生组织分类标准执行。
采用SPSS 17.0软件。采用χ2检验比较差异的统计学意义，以α＝0.05为检验水准。敏感度、特异度和预测值使用传统列联表计算，95%可信区间(95%CI)使用精确二项式方法计算。
172例(年龄24～77岁，平均43岁)，均检测HR-HPV E6/E7 mRNA、TCT。TCT结果显示，HR-HPV E6/E7 mRNA检测总阳性率为65.1%，在未见上皮内病变或恶性(NILM)中为37.9%，在意义不明的非典型鳞状细胞(ASCUS)和低鳞状上皮内病变(LSIL)为67.9%(36/53)，在非典型鳞状细胞不能排除高度鳞状上皮内病变(ASC-H ＋)中为88.5%(54/61)。HR-HPV E6/E7 mRNA检测阳性率在NILM、ASCUS和LSIL、ASC-H ＋各组中表达不同，随细胞学诊断升级而增高，各组间差异有统计学意义(P<0.05)。172例经病理学诊断：正常宫颈者40例，CIN Ⅰ者30例(17.4%)，CIN Ⅱ～Ⅲ者62例(36%)，SCC者40例(23.3%)，HR-HPV E6/E7 mRNA检测阳性率在CIN Ⅰ–中(包括正常宫颈、炎症和CIN Ⅰ)为38.6%，在CIN Ⅱ～Ⅲ上升至77.4%，在SCC中为92.5%。HR-HPV E6/E7 mRNA检测阳性率随宫颈病变由CIN到宫颈癌病理学级别加重而显著增高，P<0.05，表1。
HR-HPV E6/E7 mRNA阳性与细胞学、组织学诊断关系(例)
HR-HPV E6/E7 mRNA阳性与细胞学、组织学诊断关系(例)
| 诊断 | 例数 | HPV E6/E7mRNA阳性 | |
|---|---|---|---|
| TCT | |||
| 正常 | 58(33.7) | 22(37.9) | |
| ASCUS | 40(23.3) | 29(72.5) | |
| LSIL | 13(7.6) | 7(53.8) | |
| ASC-H ＋a | 61(35.5) | 54(88.5) | |
| 病理学 | |||
| CIN Ⅰ–b | 70(15.7) | 27(38.6) | |
| CIN Ⅱ～Ⅲ | 62(36.0) | 48(77.4) | |
| SCC | 40(23.3) | 37(92.5) | |
注：括号内为百分率(%)；aASC-H ＋，包括ASC-H，HSIL，SCC；b CIN Ⅰ–，包括正常宫颈，炎症和CIN Ⅰ
172例均进行TCT、HR-HPV E6/E7 mRNA及HC-2 HPV DNA检测，其中102例CIN Ⅱ ＋中HR-HPV E6/E7 mRNA阳性85例，灵敏度83.3%，95%CI(74.9%，89.3%)；HC-2检测阳性95例，灵敏度为93.1%，95%CI(86.5%，96.6%)。70例CIN Ⅰ–中HR-HPV E6/E7 mRNA检测阴性43例，特异度61.4%，95%CI(49.7%，72%); HC-2检测阴性38例，特异度54.3%(38/70)，95%CI(42.7%，65.4%)。HR-HPV E6/E7 mRNA检测特异度显著高于HC-2(61.4%，54.3%，P<0.05)。172例中HR-HPV E6/E7 mRNA和HC-2两种检测方法一致性为72.7%(125/172)，表2。
HR-HPV E6/E7 mRNA与HC-2的比较(例)
HR-HPV E6/E7 mRNA与HC-2的比较(例)
| 病理学 | mRNA | HC-2 | 合计 | ||
|---|---|---|---|---|---|
| 阳性 | 阴性 | 阳性 | 阴性 | ||
| CIN Ⅱ ＋a | 85 | 17 | 95 | 7 | 102 |
| CIN Ⅰ–b | 27 | 43 | 38 | 32 | 70 |
| 合计 | 112 | 60 | 133 | 39 | 172 |
注：a CIN Ⅱ＋，包括CIN Ⅱ，CIN Ⅲ，SCC；b CIN Ⅰ–，包括正常宫颈、炎症和CIN Ⅰ
172例均进行TCT、HR-HPV E6/E7 mRNA、Cervista检测，其中CIN Ⅱ＋ 102例，HR-HPV E6/E7 mRNA检测阳性85例，灵敏度83.3%，95%CI(74.9%，89.3%); Cervista检测阳性91例，灵敏度89.2%(91/102)，95%CI(81.7%, 93.9%)。70例CIN Ⅰ–中HR-HPV E6/E7 mRNA检测阴性43例，特异度61.4%，95%CI(49.7%，72%); Cervista检测阴性39例，特异度55.7%，95%CI(44.1%，66.8%)。HR-HPV E6/E7 mRNA检测特异度显著高于Cervista检测(61.4%，55.7%，P<0.05)。172例中HR-HPV E6/E7 mRNA和Cervista两种检测方法一致性为72.7%(125/172)，表3。
HR-HPV E6/E7 mRNA和Cervista检测结果的比较(例)
HR-HPV E6/E7 mRNA和Cervista检测结果的比较(例)
| 病理学 | mRNA | Cervista | 合计 | ||
|---|---|---|---|---|---|
| 阳性 | 阴性 | 阳性 | 阴性 | ||
| CIN Ⅱ＋a | 85 | 17 | 91 | 11 | 102 |
| CIN Ⅰ–b | 27 | 43 | 31 | 39 | 70 |
| 合计 | 102 | 60 | 122 | 50 | 172 |
注：a CIN Ⅱ＋，包括CIN Ⅱ，CIN Ⅲ，SCC；b CIN Ⅰ–，包括正常宫颈、炎症和CIN Ⅰ
172例中CIN Ⅱ ＋102例，对CIN Ⅱ ＋的诊断，HR-HPV E6/E7 mRNA、HC-2、Cervista 3种检测方法的灵敏度分别为83.3%、93.1%、89.2%，HC-2检测的灵敏度最高；HR-HPV E6/E7 mRNA、HC-2、Cervista 3种检测方法的特异度分别为61.4%、54.3%及55.7%，HR-HPV E6/E7 mRNA检测的特异度最高，表4。
比较HR-HPV E6/E7 mRNA、HC-2和Cervista检测CIN Ⅱ ＋的诊断效能
比较HR-HPV E6/E7 mRNA、HC-2和Cervista检测CIN Ⅱ ＋的诊断效能
| 方法 | 灵敏度 | 特异度 | PPV | NPV |
|---|---|---|---|---|
| HR-HPV E6/E7mRNA | 83.3(74.9，89.2) | 61.4(49.7，72.0) | 75.9(67.2，82.9) | 71.7(59.2，81.5) |
| HC-2 | 93.1(86.5，96.6) | 54.3(42.7，65.4) | 74.8(66.6，81.5) | 84.4(71.2，92.3) |
| Cervista | 89.2(81.7，93.9) | 55.7(44.1，66.8) | 74.6(66.2，81.5) | 78.0(64.8，87.2) |
注：括号内为95%CI
HR-HPV E6/E7 mRNA、HC-2、Cervista 3种检测方法的ROC曲线下面积分别为0.819、0.759和0.709，HR-HPV E6/E7 mRNA的ROC曲线下面积最大。当约登指数取最大值时，HR-HPV E6/E7 mRNA的诊断阈值为2.84，诊断的敏感度为62.4%，特异度为89.8%; HC-2 HR-HPV DNA的诊断阈值为10.4，诊断的敏感度和特异度分别为84.9%和62.7%，图1。
近年来已将HR-HPV DNA检测纳入宫颈癌筛查项目，已成为目前应用较为广泛的检测技术。HPV DNA检测敏感性较高，但特异性并不理想[5]。鉴别可能引起高级别宫颈病变的持续性HPV感染，则需要反复监测HPV分型，反复的检测可能增加HPV感染的机会。探寻一种能够简便、准确识别宫颈病变进展风险的检测方法，使其既有与HC-2相似的灵敏度又有较高的特异度，进而更有效地进行宫颈病变的筛查并指导后续的随访管理。
HR-HPV发生致癌作用的主要基因为E6、 E7和E2, HPV DNA整合于宿主染色体脆弱区，使编码特异性DNA束缚蛋白的E2区破坏，而E6、E7转化作用受E2的调控，从而引起E6和E7两种癌基因的过表达[8]。E6、E7蛋白可通过抑制p53、Rb等抑癌基因功能、激活端粒酶活性、抑制细胞凋亡和逃逸正常免疫监视等机制，最终导致细胞周期失控并永生化成为癌细胞。本研究表明，E6、E7基因的持续性表达是宫颈上皮细胞发生恶性转化及持续进展为宫颈浸润癌的必要条件，HR-HPV E6/E7在HR-HPV的致癌基因活性中起到了关键作用。检测HR-HPV E6/E7 mRNA转录物可发现HPV癌基因的活化状态，与HPV DNA检测相比，HR-HPV E6/E7 mRNA检测判断HPV感染与预测病变进展的风险更有利，从而成为宫颈病变筛查的有效方法[9]。
目前，国外使用核酸序列扩增方法检测HR-HPV E6/E7 mRNA，主要有二种方法：一种是APTIMA HPV，可检测14种HR-HPV E6/E7 mRNA(HPV-16, -18，-31，-33，-35，-39，-45，-51，-52，-56，-58，-59，-66，-68)，测试临床灵敏度类似于HC-2，但较HC-2提高了特异度[10]。另一种是PreTect HPV检测，检测5种最常见的HR-HPV E6/E7 mRNA(HPV-16型，18，31，33和45)，并已在欧洲使用了一段时间，PreTect HPV检测比HPV DNA测试的特异度高，但灵敏度低。本研究选用国产的Quanti Virus® HR-HPV E6/E7 mRNA诊断试剂盒，在残留TCT样品中直接定量测试14种HR- HPV E6/E7 mRNA(HPV-16，18，31，33，35，39，45，51，52，56，58，59，66和68)。是测试HR-HPV E6/E7 mRNA的新方法，采用类似三明治的核酸杂交方法，可直接定量检测液基细胞学剩余标本中的HPV mRNA,放大捕获目标DNA/RNA信号，放大倍数明确，重复性、稳定性高，可以对DNA/RNA做精确的定量检测及动态水平研究。克服了传统实时PCR技术中的缺陷与不确定因素，无需抽提纯化RNA、反转录及PCR扩增，只需将样本用特定裂解液裂解，经探针杂交与信号放大即可迅速得到精确结果，重复性、稳定性和灵敏度高。
当前宫颈病变研究中的重要课题是如何分流HR-HPV阳性的妇女，若对所有HR-HPV DNA阳性妇女均进行阴道镜检查，不仅造成过度诊断、过度治疗，而且导致医疗成本过高并增加了这部分人群的心理压力，有可能引起焦虑情绪，甚至不良后果。研究表明，宿主细胞的E6/E7 mRNA转录物或蛋白质的表达与宫颈上皮内瘤变严重程度显著相关，E6/E7 mRNA作为一种临床预测标志，可增强宫颈癌筛查效率并预测宫颈病变的结局。本研究显示，HR-HPV E6/E7 mRNA阳性率不仅随组织学严重程度上升而增加，而且也随细胞学严重程度上升而增加，与相关的研究一致，Varnai等随访66例HPV DNA检测阳性的妇女，以PreTect HPV方法检测HR-HPV E6/E7 mRNA，18个月后检测宫颈状态，HR-HPV E6/E7 mRNA与HPV DNA的一致率为97%，并且与细胞学和组织学级别的升级相关。可见HR-HPV E6/E7 mRNA表达与宫颈病变的程度密切相关，检测HR-HPV E6/E7 mRNA有助于预测HR-HPV持续感染导致宫颈病变进展的风险，更有利于宫颈癌筛查中准确分流HR-HPV阳性的妇女。
本研究中HR-HPV E6/E7 mRNA检测比HC-2检测和Cervista检测具有更高的特异性，较少的假阳性率。比较三者ROC曲线，HR-HPV E6/E7 mRNA检测具有更好的诊断效能。提示HR-HPV E6/E7 mRNA检测，在宫颈癌筛查随访中将会减少隐匿HPV感染妇女的过度检查和治疗，更适用于ASCUS和LSIL妇女的分流。
本研究提示HR-HPV E6/E7 mRNA可以反映HR-HPV癌基因的活性，具有比HR-HPV DNA更高的特异度，而灵敏度相似，HR-HPV E6/E7 mRNA与宫颈病变程度密切相关，可早期预测HR-HPV持续感染导致病变进展的风险，有望成为宫颈病变筛查及分流的新方法。
